Антиклея: Антиклея (Зигаденус): посадка и уход за цветком, описание, фото

Содержание

Антиклея (Anticlea) — описание, выращивание, фото

Содержание

Описание

До XXI века название Антиклея употреблялось только в качестве синонима. Однако исследования на молекулярном уровне доказали неотъемлемое право на родовую самостоятельность. Род Антиклея практически опустошил ряды рода Зигаденус, попутно забрав большинство видов Стенантиума.

В наши дни Антиклея — общее наименование 11 видов травянистых многолетников из семейства Мелантиевые. Луковичные растения образуют прикорневую розетку из длинных листьев с заостренными кончиками. Листовые пластины линейной формы окрашены в зеленый цвет с сизоватым оттенком.

Летом из центра розетки вытягивается цветонос. Стеблевые листочки редкие и маленькие, крепятся к побегу короткими черешками. Высота цветоноса доходит до метра.

Маленькие цветочки белые, часто с легкой примесью желтого или зеленого тона. Они образуют объемные кистевидные или метельчатые соцветия. Отличительный признак рода — зеленая железа сердцеобразной формы у основания каждого лепестка и чашелистика. Из центра выпирают бело-зеленые тычинки, пыльники которых ближе к концу цветения становятся ярко-желтыми. Запаха цветы не имеют.

Цветение длится свыше месяца, на исходе лета появляются плоды — коробочки, наполненные мелкими коричневыми семенами.

Выращивание

Антиклея — прекрасное растение для оригинальных садовых композиций. Особенно хорошо она смотрится в групповых посадках. Эти представители флоры отлично приживаются у водоемов и на участках с влажной почвой, а также на каменистых горках.

Окончание цветения не ведет к потере декоративности. Прикорневые листья Антиклеи не отмирают и не сморщиваются. Аккуратная розетка сохраняет привлекательный внешний вид до холодов.

Все части растения содержат токсины. Мелкие и крупные вредители предпочитают держаться от Антиклеи на расстоянии.

Эти растения размножают в культуре не только семенами, но и делением куста. Процедуру проводят весной. Каждая деленка должна получить 3–4 луковицы. Очень бережно следует обращаться с корнями, поэтому от использования ножа или ножниц желательно отказаться. После ручного деления отдельные растения высаживают, располагая корневище у поверхности почвы. Молодые Антиклеи поливают чаще и обильнее, чем взрослые экземпляры.

Болезни и вредители

Гнили.

Размножение

Семенами, луковицами, делением куста.

Первые шаги после покупки

Антиклею выращивают из луковиц и из семян. При приобретении луковиц надо выбирать плотные, без признаков гнили экземпляры с неповрежденной оболочкой. Высаживают их весной.

Всхожесть семена Антиклеи теряют очень быстро. Качественным считается посадочный материал исключительно текущего года. Высевают их в контейнеры с плодородной почвой. Ростки всходят медленно и не дружно. После образования 3–4 настоящих листьев необходима пикировка. Лучше использовать торфяные горшочки. В этом случае при пересадке риски повреждения корневой системы значительно снижаются. До весны сеянцы содержат в прохладном помещении. В мае Антиклеи перемещают на отведенное место, подкармливают комплексным минеральным удобрением. Поливают до укоренения часто.

Секреты успеха

Антиклея может приспособиться к существованию на освещенных участках. Но наиболее комфортно чувствует себя в полутени.

Для полноценного развития растению нужен плодородный грунт. На скудных почвах Антиклея не достигает заявленной высоты.

Кратковременная засуха не наносит вреда здоровью растения. Однако Антиклея с благодарностью отзывается на регулярные умеренные поливы. Воду желательно вливать под розетку, избегая попадание жидкости на листовые пластины.

Антиклея легко привыкает к температурам воздуха любого региона. В жару нуждается в более частых поливах. Растение отличается морозоустойчивостью. Зимует без укрытия при похолодании до -40°C.

Возможные трудности

В силу особенностей строения корневой системы (яйцевидные луковицы связаны корневищем) Антиклея наращивает розетки очень медленно. При выращивании из семян цветение наступает, как правило, на 4 год. Из луковиц — на третий.

После деления и пересадки растение также берет 1–2-годичный тайм-аут.

Ядовиты все части Антиклеи. При уходе желательно надевать перчатки и соблюдать меры предосторожности. Особенно аккуратно следует хранить луковицы, содержащие большое количество токсинов. В свое время растение погубило немало коренных индейцев и американских поселенцев из-за сходства подземной части с репчатым луком и вполне съедобными луковицами Камассии.

При высаживании Антиклеи важно не переусердствовать с заглублением. В противном случае корневая шейка загнивает, что оборачивается преждевременной гибелью растения.

На ярко освещенных участках цветение оскудевает.

Редакция LePlants.ru

Википедия — свободная энциклопедия

Избранная статья

Прохождение Венеры по диску Солнца — разновидность астрономического прохождения (транзита), — имеет место тогда, когда планета Венера находится точно между Солнцем и Землёй, закрывая собой крошечную часть солнечного диска. При этом планета выглядит с Земли как маленькое чёрное пятнышко, перемещающееся по Солнцу. Прохождения схожи с солнечными затмениями, когда наша звезда закрывается Луной, но хотя диаметр Венеры почти в 4 раза больше, чем у Луны, во время прохождения она выглядит примерно в 30 раз меньше Солнца, так как находится значительно дальше от Земли, чем Луна. Такой видимый размер Венеры делает её доступной для наблюдений даже невооружённым глазом (только с фильтрами от яркого солнечного света), в виде точки, на пределе разрешающей способности глаза. До наступления эпохи покорения космоса наблюдения этого явления позволили астрономам вычислить расстояние от Земли до Солнца методом параллакса, кроме того, при наблюдении прохождения 1761 года М. В. Ломоносов открыл атмосферу Венеры.

Продолжительность прохождения обычно составляет несколько часов (в 2004 году оно длилось 6 часов). В то же время, это одно из самых редких предсказуемых астрономических явлений. Каждые 243 года повторяются 4 прохождения: два в декабре (с разницей в 8 лет), затем промежуток в 121,5 года, ещё два в июне (опять с разницей 8 лет) и промежуток в 105,5 года. Последние декабрьские прохождения произошли 9 декабря 1874 года и 6 декабря 1882 года, а июньские — 8 июня 2004 года и 6 июня 2012 года. Последующие прохождения произойдут в 2117 и 2125 годах, опять в декабре. Во время прохождения наблюдается «явление Ломоносова», а также «эффект чёрной капли».

Хорошая статья

Резня в Благае

(сербохорв. Масакр у Благају / Masakr u Blagaju) — массовое убийство от 400 до 530 сербов хорватскими усташами, произошедшее 9 мая 1941 года, во время Второй мировой войны. Эта резня стала вторым по счету массовым убийством после создания Независимого государства Хорватия и была частью геноцида сербов.

Жертвами были сербы из села Велюн и его окрестностей, обвинённые в причастности к убийству местного мельника-хорвата Йосо Мравунаца и его семьи. Усташи утверждали, что убийство было совершено на почве национальной ненависти и свидетельствовало о начале сербского восстания. Задержанных сербов (их число, по разным оценкам, составило от 400 до 530 человек) содержали в одной из школ Благая, где многие из них подверглись пыткам и избиениям. Усташи планировали провести «народный суд», но оставшаяся в живых дочь Мравунаца не смогла опознать убийц среди задержанных сербов, а прокуратура отказалась возбуждать дело против кого-либо без доказательства вины. Один из высокопоставленных усташей Векослав Лубурич, недовольный таким развитием событий, организовал новый «специальный суд». День спустя дочь Мравунаца указала на одного из задержанных сербов. После этого 36 человек были расстреляны. Затем усташи казнили остальных задержанных.

Изображение дня

Эхинопсисы, растущие на холме посреди солончака Уюни

Антиклея (Зигаденус)

Антиклея (Зигаденус) — Anticlea ( Zigadenus)
Сем. Лилейные — Мелантиевые

Антиклеи, или Зигаденусы настолько благородные растения, что, честно говоря, даже трудно найти им конкурентов. В них прекрасно все: и как они весной вылезают из земли, и как они благородно отцветают, и какие у них листья осенью – они всегда совершенны. И сам цветок, несомненно, хорош! Все виды рода — луковичные растения, они достаточно декоративны и пригодны для садовых композиций.

А. изящная (А. elegans) — одна из красивейших в роде. Произрастает в Северной Америке компактными группами. Узкие сизые листья собраны в прикорневые пучки высотой до 60 см. Цветет в начале лета. Цветки многочисленные, мелкие, желто-зеленые, собраны в метельчатое соцветие на плотном цветоносе высотой около 100 см. Луковицы вытянутые, связанные корневищем. Летнего покоя не имеют. Предпочитает богатые почвы.

Хорошо развивается как в полутени, так и на открытых солнцу местах. Влаголюбива (в природе растет на заливных лугах), но выносит временную пересушку. Зимостойка без укрытия. Наиболее простой способ размножения — деление «гнезда» рано весной или после отцветания. Антиклеи всегда плохо переносят пересадки: они приживаются, но долго болеют.
А. Нутталля (Z. nuttallii = Amianthium nuttallii = Toxicoscordion nuttallii), представитель американской флоры, имеет совсем другой вид, ее легко отличить.

Наш местный вид, А. сибирская (Z. sibiricus = Melanthium sibiricum L. = Anticlea sibirica), малодекоративна и представляет интерес больше для коллекционеров.
Они могут расти в тени и на солнцепеке, в сухости и в болоте, как в природе – универсальные растения. Но в полной красе они показывают себя только на богатой почве в притененном месте. Если антиклея посажена в богатую плодородную землю, она вырастает гигантским кустом.

Антиклея  – чрезвычайно стройное элегантное растение. Удивительно хороша при высадке небольшими группами возле камней. Пригодна практически для любых посадок, в том числе для каменистых садов, «болотца» и миксбордера.

© Сады Северо-Запада.
Это экологический проект.
Помогите ему стать доступным каждому.
При цитировании помещайте активную ссылку
http://sadsevzap.ru

Антиклея изящная (Anticlea elegans) — описание, выращивание, фото

Антиклея или зигаденус: особенности выращивания и размножения

Антиклея (лат. Anticlea) или Зигаденус (лат. Zigadenus) является родом растений семейства Лилейных, хотя некоторые ученые относят к Милантиевым. В природных условиях растет в Северной Америке, Сибири, Японии.

Описание

Корневая система многолетнего декоративного растения представлена луковицей в пленочной оболочке. Прямостоячий стебель высокорослых видов зигаденуса достигает высоты до 1,2 метра, а низкорослых – до 0,5 метра. Листья узкие почти линейные, зеленого окраска с белесым восковым налетом. Нижние собраны в прикорневую розетку, в длину примерно 20 см, стеблевые — располагаются по стелю на значительном расстоянии друг от друга, гораздо меньше прикорневых.

Бело-желтые или бело-зеленые цветы некрупные, собраны в кистевидные соцветия, формируются на верхней части стебля, охватывая около 30 см. Околоцветник воронкообразный, состоит их 6-и долей, сросшихся в нижней части. Период цветения — летние месяцы.

Плод представлен в виде коробочки, состоящей из 3 граней. Семена имеют светло-коричневую расцветку. Все части антиклеи ядовиты для человека. В народной медицине ее используют в настойках для наружного применения. Из-за ядовитых свойств зигаденус известен как средство борьбы с паразитами у животных, тараканами, вредителями растений.

Виды, использующиеся в цветоводстве

Род антиклея насчитывает около 25 видов, но в качестве декоративных растений цветоводы выращивают только некоторые из них:

А. изящная (лат. A. Elegans) – наиболее популярный вид в цветоводстве. В высоту может превышать 1 метра. Корень представлен продолговатыми луковицами, связанными корневищем. Жесткие узкие (до 1,5 см) листья вырастают пучком в длину около 60 см. Период цветения начинается в июне. На высоком цветоносе распускаются мелкие цветы желтовато-зеленого цвета.

А. Нутталля (лат. А. nuttallii) – средневысокое растение, максимальная высота которого может быть 60 см. Вдоль сложенные узкие листья (до 2 см) покрыты сизым налетом. Белые цветочки, диаметром до 1,2 см, распускаются в начале лета.

А. сибирская (лат. A. Sibirica) – высокорослое растение (до 80 см), распространившееся из территории горных массивов России и Северной Японии. Длина листьев до 20 см, а ширина, начиная с 1 см у основания, сужается к концам до 0,5 см. Прицветники имеют темно-фиолетовую раскраску. Белые цветочки диаметром не превышают 1 см.

А. Фремонта (лат. А. Fremontii) – в природных условиях произрастает в лесных массивах США. Длинные полуметровые листья имеют ширину до 3 см. Декоративный куст буйно цветет в начале лета, может выпустить до 80 цветков, диаметр которых значительно больше в сравнении с прочими видами (около 2,5 см).

Фотогалерея видов

Выращивание и уход

Декоративный травянистый куст предпочитает освещенную местность, но цветет в полутени дольше. Хорошо развиваются посадки антиклеи на богатых гумусом и минеральными веществами почвах. Для пышного цветения требуется обильный полив. Но переувлажнение может привести к загниваю луковицы. В период жары зигаденус может выдержать временное отсутствие влаги.

Перемещать антиклею следует только в крайнем случае. Декоративный куст плохо переносит пересадку, прекращает выпускать цветы и замирает в росте на длительное время. Зигаденус достаточно морозоустойчив, поэтому на зиму не требует специального укрытия.

Размножение

Антиклея размножается 2 способами:

Семенами. Для выращивания антиклеи из семян, после созревания плода из коробочки достают семена и сохраняют в прохладном месте до весны. Для роста рассады потребуется достаточно много времени. Окрепшие ростки следует пикировать в отдельные контейнеры. При наступлении зимнего периода саженцы в контейнерах вкапывают в землю, накрывают высоким шаром соломы или сухих листьев. Весной молодые антиклеи высаживают в открытый грунт или в просторный горшок, если растение планируется выращивать в комнатных условиях. Цветов следует ожидать только на 3 или 4 год.

Вегетативно. Весной или после завершения периода цветения зигаденус можно разделить на более мелкие пучки, которые высаживают неглубоко на расстояние 20 см друг от друга. До полного укоренения требуется обильный полив.

Болезни и вредители

Поскольку антиклея ядовита, она не подвергается нападению вредителей. Единственная проблема, с которой могут столкнуться цветоводы, это загнивание луковиц в результате переизбытка влаги, что может привести к гибели растения.

Использование в ландшафтном дизайне

Растение высаживают небольшими пучками среди камней. Можно использовать для декоративного украшения каменистых берегов искусственного фонтанчика или озерца. Гармонично соседствует с любыми кустарниками.

Имея неяркие мелкие цветочки, своим пышным пучком зеленых листьев может подчеркнуть красочность ярких цветов: роз, гвоздик, гладиолусов и др.

Горец (лат. Polygonum) или гречишник – род травянистых буйно растущих и обильно цветущих растений семейства Гречишные (лат. . Далее

Императа цилиндрическая (лат. Imperata cylindrica) — единственный вид рода Императа, использующийся в ландшафтном дизайне. Растения привлекают внимание . Далее

Трясунка (лат. Briza) или бриза – род травянистых растений семейства Злаковых (лат. Poaceae). Латинское название рода встречается . Далее

Хаконехлоя (лат. Hakonechloa) или Хаконехлоа – род травянистых растений, относящийся к семейству Злаки (лат. Poaceae). Представителей этого . Далее

Кислица (лат. Oxalis) – род одно- или многолетних трав, редко полукустарников семейства Кисличные (лат. Oxalidaceae). На английском . Далее

Фрезия (лат. Freesia) — род многолетних цветущих растений семейства Ирисовые (Касатиковые) (лат. Iridaceae). Была открыта в Южно-Африканской . Далее

Нет предела прекрасному. Эти слова относятся и к представителям семейства молочайных (лат. Euphorbiaceae), выделенных классификаторами в отдельный . Далее

Антиклея или Зигаденус: советы по выращиванию и размножению в саду

Содержание статьи:

  1. Рекомендации по посадке и уходу в открытом грунте
  2. Как провести размножение в саду
  3. Трудности в процессе выращивания и пути их преодоления
  4. Любопытные заметки и фото
  5. Виды

Антиклея (Anticlea) также встречается под названием Зигаденус (Zigadenus) и относится к семейству Лилейные (Liliaceae), хотя есть такие виды, которые включены в состав объединения Милантиевые (Melanthiaceae). В него входят представители флоры, обладающие одной семядолей в зародыше. В основном все растения рода (их насчитывают до 25 единиц) произрастают на территории североамериканского континента, в Сибири или на японских островах.

Название семействаЛилейные или Милантиевые
Жизненный циклМноголетник
Особенности ростаТравянистое
РазмножениеСеменное и вегетативное (высадка луковиц либо деление корневища)
Период высадки в открытый грунтВесна
Схема высадкиНа расстоянии 20 см
СубстратБогатый органикой, плодородный, суглинистый или супесчаный
ОсвещенностьПолутень
Показатели влажностиУмеренная
Особые требованияНеприхотливо, зимостойко
Высота растенияОт 0,3 до 1,2 м
Окрас цветовБеловато-желтый или беловато-зеленый
Тип цветов, соцветийКистевидное или метельчатое
Время цветенияЛето
Время декоративностиВесенне-летнее
Место примененияМожно применять для срезки, в качестве бордюров и украшения каменистого сада, альпийской горки
USDA-зона3, 4, 5

Своё имя растение носит благодаря переводу с греческого языка словосочетания, которое означает «пара нектарных желез», что является отображением цветка Anticlea.

Корневая система таких многолетников имеет вид луковицы, поверхность которой обернута пленочной оболочкой. Форма произрастания — травянистая. Если разновидность зигаденуса высокорослая, то ее стебли могут достигать почти 1,2 м, в то время, как параметры низкорослых видов находятся у отметки в 0,3 м. Листва разделяется на два типа: прикорневая или стеблевая. Окрас листовых пластин насыщенного зеленого колера, при этом имеется восковидный налет белесого тона, который делает их сизовато-зелеными. Те, листья, которые находятся в нижней части, собираются в листовую розетку, расположенную в прикорневой зоне. Длина их составляет почти 20 см, очертания — зауженные, черешков такие листики лишены. Листва, образующаяся на стеблях, располагается довольно редко и ее немного. Размер стеблевых листьев намного меньше, форма овально-удлиненная, черешки коротенькие.

Процесс цветения приходится на летний период. Цветоносные стебли по высоте могут варьироваться в пределах от 30 см до метра. При этом соцветие имеет форму кисти или метелочки. В него собираются цветки мелких размеров (всего 2 см в поперечнике), причем лепестки имеют желтовато-белесый или беловато-зеленый колер. Такие соцветия в основном расположены в верхней части стебля, которая может охватывать до 30-ти см.

Форма околоцветника в виде воронки, ее составляют три пары долей, которые отличаются срощенностью в нижней части или практически до середины. Род обладает тем отличием, что в основании каждого лепестки и чашелистика присутствует железка зеленоватого оттенка имеющая сердцевидные очертания. В центре цветка хорошо видны тычинки беловато-зеленого тона, выпирающие наружу. Когда приближается конец цветения, пыльники на них принимают ярко-желтый колер. Запаха цветы не имеют. Соцветия остаются на растении длительное время. Тоже касается и листовых пластин — они не сморщиваются и не начинают отмирать, а продолжают служить украшением антиклее до морозов.

Когда цветение завершается, то цветоносы не отмирают и не сохнут, продолжая придавать эффектности растению. После цветения идет вызревание плодов, которые обладают видом коробочки. Она составлена из трех граней. Внутри плода образуются семена светло-коричневого тона.

Хотя в роду есть много видов зигаденусов, но в культуре принято использовать только некоторые из них. Рекомендуется использовать для заполнения щелей между камнями, в качестве создания бордюров, в групповых посадках, около водоемов или на клумбах больших размеров, в миксбордерах. Так как цветки маленькие и не особо яркие, но листва отличается насыщенным колером, то рядом хорошо высаживать розы, гвоздики или гладиолусы.

Рекомендации по посадке и уходу за антиклеей в открытом грунте

    Выбор места для посадки. Растению большое всего по нраву место в полутени, если клумба находится под ажурной листвой деревьев. Но есть сведения, что и на солнечном участке или полном притенении Anticlea может расти, только в этом случае его скорость роста еще больше снизится, а цветение будет не таким буйным. Прямые солнечные лучи также не смогут сильно повредить зигаденусу, так как их поверхность укрывает воскоподобный налет. Но важно помнить, что пересадки очень негативно сказываются на этом представителе флоры и поэтому место нужно подобрать тщательно. Если часто тревожить корневую систему антиклеи, то кустик просто погибнет.

Температура содержания. Растение настолько непритязательное в этом отношении, что прекрасно привыкает к показателям тепла воздуха в любом регионе. Правда, если стоит сильная жара, ему потребуются частые поливы. Поражают и морозостойкие качества зигаденуса, поскольку он без вреда для себя сможет пережить морозы до 40 градусов.

Посадка Anticlea. Важно организовать качественный дренаж — в лунку на дно укладывают слой из дробленого кирпича, гальки или керамзита. Так как поперечник листовой розетки достигает более или менее 40-ка см, то лучше между саженцами оставлять 20–30 см. Так разрастаясь, растение не будут мешать другу и из них может быть организована красивая групповая посадка.

Поливы. Зигаденус отличается любовью к влажной почве, поэтому рекомендуется следить, чтобы она не пересыхала. Особенно это касается летних дней, когда долгое время нет естественных осадков. Максимальная допустимая просушка может составлять до пяти суток. Даже если растение получит большее количество влаги, но при посадке был организован дренаж, то оно никак не пострадает. Важно помнить, что залив антиклеи сразу спровоцирует загнивание, поэтому рекомендуется струйку воды направлять прямо под листовую розетку, стараясь, чтобы капли воды не попадали на листья.

Выбор почвы. Хорошо себя будет чувствовать Anticlea, когда ее высаживают в плодородный субстрат, который обладает не только питательностью, но и большим количеством микроэлементов. Поэтому грунт применяют суглинистый или супесчаный, с нейтральными показателями кислотности — рН 6,1–7,4. Если почва скудная, то растение никогда по высоте не достигнет заявленных показателей. Но если выхода нет, то придется при посадке в почвосмесь внести перегной или компост, а затем регулярно проводит подкормки органикой.

Удобрения для антиклеи вносятся с началом активизации вегетационного периода. Рекомендуется применять комплексные минеральные препараты. При этом дозировка, указанная на пачке, не нарушается. Можно использовать и органику.

  • Общие советы по уходу. Так как растение отличается зимостойкостью, то можно на зиму не применять укрытие.
  • Как провести размножение зигаденуса в саду?

    Этого экзотического представителя форы есть возможность размножать с помощью высевания семян, высадки луковиц или разделением куста.

    При семенном размножении рекомендуется собрать коробочки и извлечь из них семенной материал. Все потому, что всхожесть у семян очень быстро падает. Затем их содержат в прохладном месте до весенней поры или сразу высевают в торфяно-песочный субстрат, уложенный в рассадные ящики для выращивания рассады. При этом стратификация им не понадобится. Скорость прорастания семян очень низкая. Поэтому придется длительное время ухаживать за пустой ёмкостью с грунтом. Важно не тревожить сеянцы, чтобы они находились в полном покое.

    Когда появятся молодые антеклеи, то им дают окрепнуть и подрасти, чтобы на них развернулось 3–4 настоящих листовых пластины. Затем выполняют пикировку — рассадку сеянцев по отдельным горшочкам (лучше применять изготовленные из торфа). При пересадке замечено, что скорость роста у сеянцев зигаденуса очень падает, а некоторые экземпляры могут вообще погибнуть. Первый год рассаду рекомендуется содержать в прохладном помещении, чтобы она так пережила зимний период.

    Если же будет нужда вынести емкости с рассадным материалом на открытый воздух, то контейнеры прикапывают в почву, а затем выполняют мульчирование — поверх укладывается сухая опавшая листва или солома, чтобы такой слой был примерно 5 см. Только с приходом весны можно провести пересадку Anticlea на постоянное место в саду. Такие растения будут радовать цветением по прошествии 3–4 лет. Однако стоит помнить, что такой способ размножения дает положительные результаты у опытных садоводов, так как при нем необходимо придерживаться множества условий.

    Когда куст слишком разросся, то его можно разделить с приходом весеннего времени или уже когда закончится цветение. Деленки не стоит делать слишком мелкими, чтобы они могли быстрее адаптироваться. Так каждая часть должны содержать 3–4 луковички и постараться по максимуму сохранить корневые отростки, которые их соединяют. Так как корни очень хрупкие и чувствительные, то их рекомендуется разделить руками, отказавшись от использования садового инструмента (например, секатора), ножа или ножниц. Расстояние, на котором высаживаются части антиклеи должно не превышать 20-ти см. Пока деленки не укореняться их рекомендуется обильно поливать.

    При покупке луковиц необходимо тщательно их осмотреть, чтобы не пропустить признаков гнили. Также подвергают осмотру и поверхность материала. Луковичная пленка не должна носить следы повреждения, обладать плотностью. Высадка проводится на выбранное место в саду с приходом весны.

    Трудности в процессе выращивания антиклеи и пути их преодоления

    Так как вся надземная часть зигаденуса очень ядовита, то она не представляет интереса для вредных насекомых. Но самой большой неприятностью является загнивание луковиц, если стоит очень влажная погода или владелец переусердствовал с поливами. Это может довольно быстро привести к гибели такого экзота.

    Отмечают, что при выращивании Anticlea не стоит ждать быстрого наращивания прикорневой розетки. Также проблемой будет выступать при пересадке сильное заглубление саженцев, так как корневая шейка быстро начнет загнивать. При посадке на слишком ярко-освещенной клумбе цветение становится скудным, так как прямые солнечные лучи будут негативно влиять на закладку бутонов.

    Любопытные заметки и фото зигаденуса

    Антиклеей звали в мифах Древней Греции дочь Автолика, которая к тому же являлась внучкой бога Гермеса. По сказаниям она была спутницей богини охоты Артемиды. А также в честь этого мифического персонажа в 1907 году был назван астероид.

    И хотя все части растения ядовиты, но еще с древности знахари знали о лекарственных свойствах антиклеи. В растении содержатся многие активные вещества с наличием сильнодействующих алкалоидов. В связи с этим препараты, изготовленные на основе зигаденуса, обладают слабительным и рвотным действием, но есть еще и свойство успокаивать и снижать активность внутренних и внешних паразитов (для изгнания волосяных и лобковых вшей).

    Используется для лекарственных целей надземную часть растения. Так подобные средства издавна применялись для устранения симптомов невралгий и радикулита, они способны были облегчить, если на их основе приготовлена мазь болевые ощущения в суставах при ревматизме. Есть сведения, что подобные настойки из-за их ядовитости даже применяются для борьбы с паразитами и у животных, можно изводить в доме тараканов или лечить от вредителей растения.

    Однако из-за того, что луковицы зигаденуса очень напоминают собой такие же части репчатого лука и луковицы Камассии, растения отнесенного к семейству Спаржевые (Asparagaceae) и вполне могут быть пригодными в пищу, пострадали многие американские поселенцы, не считая многочисленных жертв среди коренного индейского населения.

    Виды антиклеи

      Антиклея изящная (Anticlea elegans). Эта разновидность является наиболее популярной в цветоводстве. Высота стеблей может варьироваться в диапазоне от 15 см до практически 1 м. Корнем служат зауженные луковицы продолговатых очертаний, которые крепко связаны с помощью корневища. Листовые пластины, как правило, растут в виде пучка, их длина может составлять 60 см при ширине около 1,5 см. На самом стебле присутствуют довольно мелкие редуцированные листики, которые отличаются жесткостью и зеленовато-сизым окрасом. Их поверхность укрыта восковидным налётом и на ней проступают множественные прожилки. Цветение начинается с приходом лета. Высокий цветонос венчает собой кистевидное соцветие из цветков с желтовато-зелеными лепестками. Цветы обладают ароматом.В природе растение предпочитает расти группами, при этом его территории распространения растянуты от земель Аляски до североамериканских местностей, переносит суровые зимы.

    Антиклея Нутталля (Anticlea nuttallii). Этот вид менее высокий, его параметры могут максимально составлять 60 см. У листовых пластин имеется сложение вдоль центральной жилки. Ширина листьев составляет почти 2 см, поверхность их с сизоватым налетом. При цветении в метельчатое соцветие собираются цветки белесого или зеленовато-белого колера, поперечник которых измеряется 1,2 см. Распускаться бутоны начинают с приходом лета.

    Антиклея сибирская (Anticlea sibirica). Растение этого вида по высоте может достигать 80 см — это параметры тонкого пряморастущего стебля. Длина листвы может составлять 20 см, при ширине 1 см. Причем к верхушке идет сужение, то ширина при этом становится всего 0,5 см. Сосредоточены листья в прикорневой зоне. Прицветники обладают темно-фиолетовым оттенком. Цветки с белоснежными лепестками, при раскрытии могут измеряться в поперечнике всего 1 см. Собираются в метелочное соцветие. Процесс цветения занимает все летние месяцы. После цветения вызревают наполненные семенами коробочки. Территория природного распространения приходится на горные массивы на землях России и Северной Японии. Предпочитает также растение берега водных артерий, лесные склоны и леса с хвойными породами деревьев. Применяется в местной медицине для утоления болей при невралгии и ревматизме, а также в качестве противопаразитического средства. В сельском хозяйстве используется для борьбы с насекомыми и вредителями.

  • Антиклея Фремонта (Anticlea Fremontii). Предпочитает в природе расти в лесах на территории США. Форма луковиц яйцевидная, в диаметре их размер может оставить почти 4 см. Листовые платины в длину приближаются к 0,5 м, со средней шириной около 3 см. Посредством листвы идет образование декоративного кустика, который начинает буйно цвести с приходом летнего времени. На цветоносе можно насчитать до 80 бутонов, которые в диаметре более крупные, чем цветки других разновидностей — почти 2,5 см. Лепестки в цветках отливают ярко-желтым колером.
  • Видео о антиклее (зигаденусе):



    Антиклея изящная (Anticlea elegans) — описание, выращивание, фото

    Одна из красивейших в роде. Произрастает в Северной Америке компактными группами.

    Растение высотой 20 – 100 см, с сизым налетом. Листья линейные, жесткие, длиной 10 – 30 см, шириной 0,4 – 1,5 см, собраны в прикорневые пучки высотой до 60 см. Цветет в начале лета. Цветки многочисленные мелкие желто-зеленые, собраны в метельчатое соцветие на плотном цветоносе высотой около 100 см. Луковицы вытянутые, связанные корневищем.

    Фотографии Константина Александрова

    Зигаденус Нутталля — Z. nuttallii (A. Gray) S. Wats. = Amianthium nuttallii A.Gray = Toxicoscordion nuttallii Rydb.

    Обитает в степной области центральных штатов США. Назван в честь исследователя флоры Запада США Т. Нутталля (Th. Nut-tall, 1786—1859).

    Растения 30—60 см высотой, светло-зеленые, сизоватые. Листья расположены у основания стебля, 0.6—2 см шир., вдоль сложенные, короче стебля, в числе 4—6. Цветки в кистевидном или метельчатом соцветии, белые, до 1.2 см в диаметре; нектарник один, округлый. Цветет в начале лета. Испытан: С-Петербург, Москва.

    Фотография Михаила Полотнова

    Зигаденус сибирский (Антиклея) – Z. sibiricus (L.) A. Gray = Melanthium sibiricum L. = Anticlea sibirica Kunth

    Произрастает в редких лесах, зарослях кустарников, трещинах скал на востоке европейской части России, в Сибири, Амурской области, Приморском и Хабаровском краях и в альпийском поясе гор в Северной Японии.

    Растение высотой 20 – 80 см. Листья у основания стебля линейные, суживающиеся к низу, длиной 10 – 20 см, шириной 0,4 – 1 см. Стеблевых листьев 1 – 2, короткие. Прицветники темно-фиолетовые. Цветки белые, собраны в рыхлую кисть, диаметром 1 см. Наружные доли околоцветника широколанцетные, внутренние ланцетные, нектарники парные, пыльники красновато-фиолетовые. Цветет в июне.

    Фотография Вячеславa Петухинa с сайта “Природа Байкала”

    Зигаденус Фремонта – Zigadenus fremontii (Torrey) Torrey ex S. Watson, Botany (Fortieth Parallel).

    Растет в США (Калифорния, Орегон) и Мексике. Смешанные и вечнозеленые леса на высоте до 1000 м.

    Луковицы до 4 см в диаметре, яйцевидные. Листья до 50 см длиной и 3 см шириной.Соцветие кистевидной или метельчатое несет от 2 до 80 цветочков диаметром до 2,5 см. Цветет в июне.

    Встречаются подвиды:
    Zigadenus fremontii var. minor R. R. Gates
    Zigadenus fremontii var. inezianus Jepson;
    Zigadenus fremontii var. salsus Jepson

    Фотография Чубаковой Алёны

    Месторасположение: предпочитает богатые почвы. Хорошо развивается как в полутени, так и на открытых солнцу местах. Влаголюбива (в природе растет на заливных лугах), но выносит временную пересушку. Зимостойка без укрытия.

    Фотография ЭДСР.

    Размножение: cеменами и вегетативно. При выращивании из семян стратификация не требуется. Сеянцы развиваются медленно. После пикировки молодые растения тревожить не рекомендуется — любые пересадки могут задержать рост или увести растения на преждевременный покой. Для лучшей перезимовки ящики с рассадой необходимо вкопать в землю, замульчировать и прикрыть сухим листом на высоту около 5 см. Наилучший вариант зимовки молодой рассады — хранение в холодном, но не морозном помещении при умеренной влажности почвы. Весной растения высаживают сразу после пробуждения в просторные ящики или в открытый грунт для дальнейшего выращивания. Зацветают на 3-4 год. Вегетативно можно размножить делением рано весной или после отцветания.

    Использование: чрезвычайно стройное элегантное растение. Удивительно хороша при высадке небольшими группами возле камней. Пригодна практически для всех типов каменистых садов, в том числе для “болотца” и миксбордера.

    Растение Зигаденус

    Название этого растения звучит непривычно, потому что выращивается садоводами оно довольно редко. Зигаденус или антиклея выглядит экзотично, и большинство людей считают, что это растение родом из тропических стран. Но, несмотря на нежность и кажущуюся хрупкость цветка, в дикой природе он успешно произрастает на территории Сибири вплоть до Аляски, поэтому выращивание и уход за ним не составляет проблем даже в зонах с суровым климатом.

    Простота агротехники и необычные цветы – благодаря этим качествам антиклея в последние годы становится желанным обитателем садов и дворов. Учитывая то, что растение является многолетним и требует к себе минимум внимания, можно понять, почему оно так быстро набирает популярность.

    Основные характеристики

    Кроме Сибири, в дикой природе зигаденус встречается на территории Японии и Северной Америки. Растение относят к роду лилейных, а его название переводится как «пара нектарных желез», что указывает на высокие характеристики цветов в качестве медоносов.

    Корневище развивается в форме луковиц, собранных вместе по несколько штук внутри одной чешуйчатой плёнки. От луковиц отходят жёсткие корни. Листья длинные и узкие, могут достигать 30 см в длину при ширине в 1,5 см. На их поверхности находится сизый восковый налёт. Высота растения в зависимости от разновидности может изменятся от 20 см до 1 м.

    Цветки появляются на цветоносном побеге, где размещены кистевидные крупные соцветия, напоминающие по структуре соцветия кустов сирени. При большом количестве соцветий стебель может опускаться вниз под собственным весом. Одна из характеристик антиклеи – продолжительное цветение, которое может наблюдаться 90 и более дней. В жарких и знойных регионах этот период нередко сокращается. Соцветия могут быть окрашены в белые, зеленоватые или жёлтые цвета. На лепестках выделяется клейкое вещество, которое блестит и делает соцветия восковыми.

    Корни, стебель, цветки и листья зигаденуса содержат ядовитые вещества, которые способны вызывать раздражения и выраженную аллергическую на коже, поэтому все контакты с этим растением должны проводиться в перчатках.

    Ядовитым антиклею делают алкалоиды, входящие в состав сока. Это вещество применяется в медицине, но в силу высокой токсичности самостоятельно готовить на его основе лекарственные препараты категорически запрещено.

    Разновидности

    В домашних условиях выращивают две разновидности, именуемые зигаденус сибирский и изящный. Много в чём они похожи, но имеют и ряд различий.

    Сибирский

    Стебель сибирской антиклеи достаточно тонкий, но это не мешает ему вырастать до 80 см в длину. Очень упругий побег не ломается от действия ветра и не прогибается под силой тяжести образовавшихся соцветий, поэтому выглядит декоративно даже в периоды неблагоприятной погоды.

    Розетка длинных листьев располагается у основания земли, но отдельные листки могут подниматься над грунтом. Метельчатые соцветия чаще всего окрашены в зеленоватые или белые тона. Цветение продолжительное, а после его завершения на побеге образуются многочисленные коробочки с чёрными семенами.

    Излюбленные места сибирского зигаденуса – побережья рек, северные и восточные склоны, просеки хвойных и смешанных лесов.

    Изящный

    Зигаденус элегантный или изящный растёт в более прохладных местах Северной Америки и Аляски. Его разные сорта имеют различную высоту: от 20 см до 1 м.

    Характерной особенностью является форма клубнелуковиц: они вытянутые и прикреплены к донцу общего корневища. Большинство узких листьев размещено в нижней части стеблевого побега. Листья обычно жёсткие и твёрдые, сизоватые, усеяны большим количеством продольных жилок.

    Цветки у антиклеи изящной отличаются особо выраженным ароматом, который привлекает насекомых-опылителей. Соцветия образуют кисть лимонного, светло-жёлтого или зеленоватого цвета. Цветение у этого вида не настолько продолжительное, как у сибирского, но он более устойчив к вымерзанию, поэтому прекрасно культивируется в условиях с суровыми зимами.

    Правила выращивания в домашних условиях

    Антиклея очень проста в уходе, главное — придерживаться основных правил, которые помогут добиться высокой декоративности этого растения.

    Месторасположение

    Для посадки зигаденуса сибирского и изящного можно выбрать открытое или полузатенённое место. В глухой тени формируется небольшое количество бутонов, а при постоянном попадании на цветы прямых солнечных лучей цветение может сильно сократиться. Полутень больше всего соответствует природным условиям, поэтому желательно сажать растение с северной стороны стены или в частичной тени от деревьев и кустарников.

    Температура

    Цветок крайне неприхотлив при выращивании в плане температуры содержания, он прекрасно адаптируется к климату разных регионов, реагируя сокращением вегетации на короткое лето. При сильном зное нужно тщательнее регулировать частоту поливов.

    Зимостойкие качества антиклеи подходят для выращивания в холодных регионах, поскольку она отлично переносит зимы с морозами до -40°С. При таком температурном режиме зимнее укрытие ей не понадобится. Если холодный период проходит без снега или на участке снежный покров сдувает ветер, грядки укрывают мульчирующим слоем из торфа или хвойного лапника.

    В более суровых условиях посадка нецелесообразна, поскольку ежегодное выкапывание на зиму исключит возможность цветения.

    Почва

    Для этого садового растения обязательно наличие плодородной почвы с большим количеством органики. На истощённых почвах антиклея сибирская и изящная будет развиваться медленнее положенного и не покажет нормального цветения даже при идеальном уходе.

    Перед посадкой нужно проверить кислотность субстрата, которая должна быть близкой к нейтральной. В случае закисления землю нейтрализуют посредством добавления гашеной извести, а при защелачивании добавляют серу или сульфат алюминия.

    Для насыщения почвы органикой и микроэлементами перед посадкой на грядки вносят компост, листовую землю, гранулированную мочевину и суперфосфат, перепревший коровяк, древесную золу или небольшое количество куриного помёта, после чего грядки перекапывают и поливают.

    Посадка

    Пересадку проводят либо весной до начала активного роста, либо осенью в конце сентября-начале октября.

    Во время высаживания стоит помнить, что корневая система зигаденуса изящного и сибирского поверхностная и не очень развитая, поэтому лунки должны быть не глубже 15-20 см. Если разместить корневище глубже, это может спровоцировать задержку в развитии и заболевание разными видами корневой гнили даже при условии хорошего ухода.

    Для простоты выращивания на дне посадочной ямки следует обустроить дренажный слой из мелкого керамзита, гальки или битой черепицы. Для образования красивой куртины луковицы располагаются не ближе 20-30 см. Если посадить их на меньшем расстоянии, то рост замедлится и соцветия будут недоразвитыми независимо от ухода.

    Антиклея сибирская и изящная очень плохо переносят пересаживание на новое место, поэтому нужно быть готовому к тому, что не все саженцы примутся. После высадки на новое место наземные части растут медленно, и на протяжении текущего года цветение может быть скудным и запоздалым, или его совсем не будет.

    Полив

    Поскольку естественная среда обитания этой культуры – болотистые и влажные места, то полив обязательно должен быть систематичным и обильным. При нормальной температуре его производят раз в неделю, а при сильной жаре ориентируются по состоянию растения и поливают посадку 2-3 раза в неделю.

    Застой воды во время выращивания для зигаденуса менее губителен, чем засуха. С коротким периодом дефицита влаги цветок справится, но летняя засуха приведёт к его высыханию.

    Подкормки

    Весной с началом вегетации и развитием зелёной массы антиклею начинают удобрять. Для этого подойдёт полный минеральный комплекс с высокой долей азота, который вносят в соответствии с инструкцией с использованием полной дозировки. После начала формирования бутонов доля азота может быть сокращена, а доля фосфора и калия – увеличена.

    Не обойтись при выращивании этой культуры и без органических удобрений. Для этого в осеннее и весеннее время ежегодно на грядки вносится перегной или компост, который равномерно распределяется по территории роста цветка.

    Болезни и вредители

    Из-за наличия в млечном соке алкалоидов паразиты не повреждают этот цветок. Единственная проблема, от которой может пострадать зигаденус – корневая гниль из-за длительного застоя влаги. В целях профилактики загнивания корней для посадки выбирают проницаемые почвы и оборудуют дренаж в посадочной яме.

    Размножение

    Размножение зигаденуса сибирского или изящного проводят семенным и вегетативным методом. Многие садоводы считают семенной способ слишком хлопотным. Ещё одним его недостатком является длительный период до начала первого цветения.

    Семенами

    Семена можно приобрести в цветочном магазине или собрать из дозревшей коробочки взрослого куста. Всхожесть быстро падает на протяжении первого года, поэтому позапрошлогодний посадочный материал считается просроченным.

    До посадки семена должны находиться в прохладном сухом месте, но в полной стратификации они не нуждаются. Посев начинают не раньше февраля, чтобы появившимся сеянцам хватило света после прорастания.

    Время появления первых всходов колеблется от двух до трёх месяцев, но всё это время за посевами нужен уход, заключающийся в периодичном поливе после просыхания верхнего слоя грунта. Рыхлить землю до появления первых ростков нельзя, чтобы не повредить их в почве.

    После прорастания сеянцев можно удобрить их половинной дозой минерального комплекса для лиственных растений. На стадии настоящего четвёртого листка проводят пикировку. Сеянцы рассаживают в отдельные стаканчики или торфяные горшки, стараясь не нарушить земляной ком с корнем. Сразу после этого скорость роста молодых кустов замедлится, но за несколько недель постепенно восстановится.

    До первой зимы рассада развивается в индивидуальных ёмкостях. Уход за ней сводится к периодичному поливу с использованием подкормок. На зиму подкормки прекращают и переносят горшки в прохладное освещённое место с температурой около 7-10°С. В тёплых регионах рассаду зигаденуса на зиму выносят на открытый воздух, где прикапывают её в землю вместе с горшками и мульчируют сухой листвой или соломой толщиной 5 см.

    Весной рассаду можно высадить на постоянное место, после чего выращивание идёт с соблюдением общих правил ухода. Цветения при семенном способе стоит ожидать только на 3-4 год после посева.

    Луковицами

    Для посадки и выращивания антиклеи сибирской и изящной луковицы можно приобрести в специализированном магазине. Во время покупки следует проверить клубни на наличие гнили. Луковица должна быть плотной и целой.

    Если для размножения используется взрослый разросшийся экземпляр, то весной перед началом активного роста или осенью после прекращения цветения корень полностью выкапывается. Попытки разделить куст выкапыванием одной части корня приводят к гибели всего растения, поскольку клубнелуковицы очень плотно прижаты друг к другу и легко повреждаются.

    Делить донце нужно таким образом, чтобы в одной части оставалось не менее 3-4 крупных луковиц. Детки при этом не учитываются. Корневые отростки убирать не стоит, их сохранение поможет быстрее адаптироваться зигаденусу после высадки и сформировать здоровый экземпляр. Корни очень хрупкие, поэтому их разделение выполняют только вручную, не забыв при этом защитить руки перчатками.

    После разделения новые экземпляры высаживают на расстоянии 20-25 см друг от друга. До полного укоренения и появления признаков активного роста молодые посадки нуждаются в активном увлажнении.

    После пересаживания уход и выращивание проводится по общим правилам. Цветение в первый год после деления, как правило, не происходит, а иногда первые бутоны появляются только на третий год.

    Антиклея изящная (Anticlea elegans) — описание, выращивание, фото

    Антиклея из семян

    Кажется это растение еще не обсуждалось или я поиском не умею пользоваться.
    Давно хотела антиклею, нашла только ее семена. Хочу спросить стОит ее сеять или лучше купить корешком. И если кто-то выращивал из семян, то как сеянцы перенесли первую зиму?

    Ol-ka
    Санкт-Петербург
    07.03.2006
    01:54:48

    Когда сеял – взошла после второй зимы, т.е. стратификация нужна обязательно.
    В первый год – злаколистная былинка, но распикированные в о.г. хорошо перезимовали и зацвели на 3-й год.
    Так что дело не быстрое, зато сразу много.

    Михаил
    Москва – Подмосковье
    07.03.2006
    14:11:59

    Не забудьте:она ядовита!И,по-моему не любит пересадку.

    Hobby
    Москва
    07.03.2006
    14:13:07

    Что и правда так ядовита? :))
    Пока не встречал никого кто бы ею отравился, наверное народ ее есть не пробовал :))
    Пересаживается и делится вполне спокойно. Но зачем ее пересаживать и делить? она красива именно когда много лет не деленная.

    Константин
    Москва
    07.03.2006
    14:30:11

    если есть дети или животные,то про ядовитость, ИМХО,знать надо обязательно!

    Hobby
    Москва
    07.03.2006
    16:14:52

    Спасибо! А я даже спрашивать не стала про стратификацию, ведь и в ЭДСР и у Марковского написано: “стратификация не требуется”.
    Михаил, я правильно поняла, что былинки зимовали на улице распикированные в о.(?) горшки и закопанные в землю. Укрывали их на зиму?
    Я тоже читала, что плохо переносит пересадку, значит если купить корешком может и не прижиться?

    Ol-ka
    Санкт-Петербург
    07.03.2006
    16:14:59

    Купила прошлым летом маленьким корешком.Особых проблем с приживанием не было.Ушла в зиму нормально.Весной посмотрим,как перезимует.

    marasha
    Суздаль
    07.03.2006
    16:59:11

    Кто сию муть запустил интересно про плохое приживание? Нарастает она не очень быстро и делить ее не часто можно это другое дело.

    Да marasha – про перезимовку можно точно не беспокоится – лично у меня живет лет под 20 и брал я у женщины опять же у которой дача была и есть под Москвой – никогда не слышал про проблемы с ней. Это растение средних широт (ряд видов растет в Сибири и на Сахалине) и достаточно зимостойко.

    Ну а про ядовитость – куча растений куда более ядовита. Антиклея же ничем не привлекательна – ни тебе ярких цветов ни интересной зелени – кому она нужна. Детей надо воспитывать чтобы ничего не хватали они запросто могут спутать дудник с цикутой или борщевником ну или волчеягодника наесться. Животные и сами не тронут – они не дураки – у меня пес предпочитает райграс есть а не местный пырей.

    Константин
    Москва
    07.03.2006
    17:52:05

    Константин, неужели антиклея непривлекательна? А я-то уж третий год о ней мечтаю.:( Из семян вырастить практически не получилось. Пишу “практически”, т.к. вылезло “что-то” (стратифицировала с конца января по конец марта под снегом на даче) – действительно “злаколистная былинка”, причем одна из 10 семян.:( Может все-таки “она”? Такая жесткая узкая вроде с зачатком луковички на корешке. За сезон подросла очень мало – до

    8 см.
    ИМХО, плохо они переносят не пересадку, а пикировку и только в связи с тем, что корешок у сеянца очень ломкий, а т.к. растение луковичное, то облом корешка равносилен гибели.:((

    Багира
    Москва
    07.03.2006
    19:20:31

    Давайте различать разную привлекательность :))
    Я писал о привлекательности детям по очередной отсылке что дескать растение ядовито.
    Детям что интересно – сорвать яркий цветок, большой красивый лист, ягоды попробовать. в этом плане для них антиклея просто никакое растение – цветы мелкие и зеленоватые, листья на траву похожи, ягод нет.
    Как некое садовое растение, тем более когда оно старое и крупное, это весьма привлекательное растение для середины лета.
    Про смертельный для луковицы облом корня извините не понял. Правда я пикировкой луковичных обычно не страдаю.

    Константин
    Москва
    07.03.2006
    22:39:06

    Багира, похоже, она.
    У меня к концу первого лета представляла собой пучки из 5-6 листиков см по 6-8 высотой. Пикировку перенесла без каких-либо проблем, зацвели отдельные растения на второй год.

    Натали
    Санкт-Петербург
    07.03.2006
    23:01:14

    Антиклея начала всходить через три недели, без стратификации.Очень крепкие и зеленые росточки.

    Ivanova
    Черкассы, Украина
    07.03.2006
    23:45:03

    Багира, растение очень и очень красивое. Все, кто приходит, сразу его выделяют:)) Одно из моих любимых после роз, конечно:)

    Lara
    Москва
    07.03.2006
    23:58:08

    Ну вот. Стратифицировать или нет – вот в чем вопрос.
    Поверив написанномув ЭДСР, в список на стратификацию не внесла.
    Прочитав сообщение Михаила – понеслась сеять.
    Посеяла поштучно в торфяные горшочки.
    Теперь планирую поступить так:
    На размЯкние – сутки.
    Потом – в холодильник.
    В мае – на дачу.
    Прикопать в тени и ждать.
    Если не взойдут этим летом, верить в следующую весну.
    Правильно?
    Живьем этот цветок никогда не видела, но на фото очень понравилось. Хочу.

    E.L.
    С-Пб
    08.03.2006
    00:25:03

    Константин, а я уж было честно поверила Вам в её непривлекательность!:)) Живо представила себе совершенно непривлекательные блеклые мелкие цветы в обрамлении “зелени” типа ненавистного мне пырея.:((
    А корешок у неё (в младенчестве) действительно очень хрупкий и достаточно короткий – запросто может обломиться вместе с зачатком луковицы при попытке пересадки сеянца из рассадной емкости в грунт. Во всяком случае при покупки семян (к моему сожалению не у Лёли) я была строго предупреждена, что в первый год его нельзя ни в коем случае пересаживать (по вышесказанной причине), а только вкопать вместе с емкостью в грунт. Честно признаюсь, что я не послушалась и попыталась все же пересадить мою единственную былиночку в грунт (побоялась, что в моей небольшой емкости она пересохнет). Как ни старалась, корешок все же обломился, но ниже “луковички”. Видимо поэтому у меня к концу лета образовалось не 5-6 листочков как у Натали, а только 2.:(
    E.L. ИМХО от стратификации хуже не будет. Удачи.:))

    Багира
    Москва
    08.03.2006
    02:06:46

    E.L., не заморачивайтесь со стратификацией – ставьте на свет и пусть растет. Растет она очень медленно, лишнее время ей не помешает, только сильнее будет к осени.
    Багира, моя росла в кокосовом субстрате, может, поэтому пикировалась очень легко, хотя после пикировки я вспомнила, что мне тоже говорили, что в сезон посадки ее не трогать, но все обошлось.

    Натали
    Санкт-Петербург
    08.03.2006
    22:30:45

    Ой-ой. Ну и не знаю. Тогда так сделаю: Пусть до 1 апреля в холодильнике, а потом на свет.
    Заодно можно спросить – можно ее, когда она повзрослеет, не на прямой солнечный свет, а в полутенистое место? (солнце утром всегда и на закате – закат летом строго на севере, с октября – на западе) – , ночи белые почти до середины августа)

    E.L.
    С-Пб
    08.03.2006
    23:18:10

    E.L., моя малявка посажена в полутень, вроде пока не жалуется 🙂 Мне кажется, нормально ей там будет.

    elimus
    Москва
    09.03.2006
    00:29:18

    Абсолютно неприхотливое растение. Запросто растет не просто в притенении а приличной тени.

    Константин
    Москва
    09.03.2006
    11:11:04

    Только что коллега по работе принес мартовский номер “Приусадебного хозяйства”, там оказалась статья об антиклее с иллюстрациями. Действительно, написано, что все части растения ядовиты, неприхотливо и зимует без укрытия. Мне показалось растение очень элегантным. И имеет с красивую легенду:).

    Аннет
    Москва
    09.03.2006
    11:40:03

    Ю.Б.Марковский рекомендовал на лекции стратифицировать или сеять под зиму, и ни в коем случае не пикировать в первый сезон, а перевалить в грунт всходы, не повреждая кома, и забыть про них до следующей весны. Пикировать на второй год. Могу поделиться рассадой.
    Очень не любит сухих песчаных почв. Просто дохнет. Зато в торфе процветает, зимует даже при частичном затоплении.

    LenaK
    Санкт-Петербург
    09.03.2006
    18:28:54

    Да, растение интересное.
    Аннет, а что за легенда? Вдруг не найду журнал.

    Сайт о саде, даче и комнатных растениях.

    Посадка и выращивание овощей и фруктов, уход за садом, строительство и ремонт дачи – все своими руками.

    Сюсиринхий и антиклея (фото) – посадка и уход

    Цветы сюсиринхий и антиклея – выращивание, виды и уход

    Эти растения для меня объединяет хрупкость и воздушность облика, похожая на листву злаков настолько, что несведущий народ постоянно путает, и цветки, похожие то ли на снежинки, то ли на шестилучевые крохотные звездочки. Трогательные они – сисюринхий и антиклея.

    СИСЮРИНХИЙ – многолетнее травянистое растение семейства касатиковых (Iridaceae). Название рода древнегреческое и в переводе означает «поросячий пятачок». Старик Теофраст так называл какие-то луковичные растения, близкие к ирисам. Теофраста нет уже много тысяч лет, а название осталось и нашло себе нового хозяина – род некрупных изящных растений американского происхождения. Причем ареал рода растянулся с севера на юг от Гренландии аж до Огненной Земли.

    В садах сисюринхии используются очень давно, некоторые виды даже «убежали из культуры» и встречаются как заносные по всей Европе, и в России в частности.

    Короткокорневищные многолетники с зелеными или сизоватыми листьями. Цветки сине-фиолетовые, голубые, желтоватые или красные, реже белые, шестичленные.

    ВСЕ ЧТО НЕОБХОДИМО ДЛЯ ЭТОЙ СТАТЬИ НАХОДИТСЯ ЗДЕСЬ >>>

    Значительная часть видов чисто тропического происхождения и у нас не зимует. Но те, что зимуют, милы и неприхотливы.

    СИСЮРИНХИЙ

    Сисюринхий узколистный (Sisyrinchium angustifolium). Может встречаться также под названиями Sisyrinchium anceps, Sisyrinchium bermudianum и Sisyrinchium gramineum.

    Произрастает в прериях, на болотах, в трещинах скал от теплоумеренной до субтропической зоны США и Канады, в горах в среднем поясе. Стебель высотой от 25 см до 45 см, простой или ветвистый. Цветки фиолетово-синие с желтовато-белым глазком, диаметром до 2 см, по 1-6 в соцветии. Каждый цветок открыт всего один день, но один сменяет другой в течение остаточно долгого времени. Цветет в начале лета. Есть белая разновидность Album.

    Сисюринхий калифорнийский (Sisyrinchium californicum), может встречаться в литературе как Hydastylus californicus. В природе растет на сырых лугах побережья теплоумеренной и севера субтропической зоны юго-запада США. Стебель высотой до 60 см. Листья совсем узкие, длиной до 30 см и шириной до 0,5 см. Цветки блестяще-желтые, диаметром до 25 мм, по 3-7 в соцветии. Цветет весной. Зимостойкость в условиях средней полосы все же оставляет желать лучшего. Но при условии самосева и если условия подойдут, то он в саду задержится. Это достаточно модная и популярная на Западе штучка для цветников со злаками, которые н е уходят и з тренда уже порядочное количество лет.

    Возможно, перспективными в средней полосе могут оказаться такие виды, как сюсиринхий Дугласа (Sisyrinchium douglasii) с довольно крупными, если так можно сказать о сисюринхии, ярко-красные цветками, сюсиринхий злаколистный (Sisyrinchium graminifolium) с желтыми цветками, сюсиринхий злаковидный (Sisyrinchium graminoides) с голубыми цветками, сюсиринхий вздутый (Sisyrinchium inflatum) с ярко-красными меленькими цветками.

    Сисюринхии в целом неприхотливые растения. Могут расти на любой хорошо дренированной почве, на солнце или в полутени. Но предпочитают богатые гумусом песчаные почвы и солнечное местоположение. Легко размножаются семенами или делением, часто дают самосев и могут сорничать. Если хочется ограничить самосев, то следует срезать цветоносы после цветения.

    Классические места для сисюринхия в саду – это каменистые горки и гравийные сады. Его хорошо выращивать на гравийных отсыпках. Помните, что растение это само по себе по природе недолговечное и продолжительно держаться в культуре будет за счет самосева. А в гравии для него самые благоприятные условия.

    АНТИКЛЕЯ

    АНТИКЛЕЯ (прежде зигаденус) – растение семейства осенниковых, или мелантиевых (Melanthiace-ае), раньше относили к более общему семейству лилейных (Liliaceae). В природе произрастает в Северной Америке, а один вид и в России. Луковичные растения, луковицы одеты в пленочную оболочку, одна оболочка может окутывать сразу несколько луковиц. Цветки в кистевидном или метельчатом соцветии, окраска цветков белая, желтоватая или зеленоватая.

    Наиболее распространена в культуре антиклея изящная (Anticlea elegans). На родине ее ареал доходит до Аляски (поэтому и в наших условиях она абсолютно зимостойка). Растет там по влажным горным лугам и лесам, на каменистых склонах. Растение высотой до 80 см, листья до 30 см в длину и до 1,5 см в ширину. Есть разновидность с сизыми листьями. Цветки зеленоватые снаружи и белые внутри, на них видны блестящие капельки выделений из нектарных железок, которые расположены парами в основании лепестков. Цветет с середины июля.

    Другой распространенный в культуре вид – антиклея нутталля (Anticlea nuttallii). В природе растет в американских прериях, т.е. в высокотравных формациях степного типа, на плодородных почвах, где цветет в весенний период. Высота до 60 см, длина приземистых листьев до 45 см, цветки желтоватобелые, 1,3 см в диаметре, нектарные железки одиночные.

    Антиклея Фремонта (Anticlea fremontii) также входит в число «садовых» видов. В природе произрастает на западе США. Может достигать 1 м в высоту, хотя есть и карликовые формы до 20 см.

    Единственная неамериканская антиклея – антиклея сибирская (Anticlea sibirica). Произрастает в европейской части России, в Сибири, Приморье в редких лесах, зарослях кустарников, в трещинах скал. Высота растения до 80 см, цветки белые, более мелкие, 1 см в диаметре.

    Антиклеи лучше выращивать на плодородных почвах при достаточном увлажнении. Как на солнце, так и в тени растения цветут хорошо.

    Все виды содержат токсичные алкалоиды и сильно ядовиты. Но это не препятствует их выращиванию в садах при соблюдении определенной осторожности, тем более что на самом деле ядовитых растений в наших цветниках много.

    К сожалению, антиклеи медленно нарастают и за счет вегетативного размножения их много не получишь. При этом растение максимально декоративно именно в большой куртине. А поскольку антиклеи не нуждаются в делении для омоложения, то лучше их и не терзать лишний раз.

    Для размножения ранней весной или в начале осени растение лучше выкопать полностью и отделить необходимое количество луковиц. Попытка отделить луковицы от куртины на месте, как правило, приводит к порче соседних луковиц, так как сидят они очень плотно друг к другу.

    Семена не требуют стратификации и могут быть посеяны весной. Всходы появляются при температуре 20° и похожи на всходы сорной травы. Чтобы не спутать их с настоящими сорняками, лучше использовать для посева контейнеры.

    Антиклея легко образует и самосев, но попробуй его отличи от всходов того же настырного, летящего отовсюду вейника, пока они маленькие. Неудивительно, что частенько его выпалывают.

    В первый год нарастание сеянцев очень медленное. На второй год растение уже больше похоже на взрослое. Цветение наступает на 3-4-й год, но хорошая куртина сформируется только лет через 6.

    Оценка статьи:

    Загрузка… Сохранить себе в: Антиклея изящная (Anticlea elegans) — описание, выращивание, фото Ссылка на основную публикацию

    АНТИКЛЕЯ – это… Что такое АНТИКЛЕЯ?

  • Антиклея

    — (Anticlea, Αντίχλεια). Дочь Автолика, жена Лаэрта и мать Одиссея. Она умерла от горя, причиненного ей долгим отсутствием сына. (Источник: «Краткий словарь мифологии и древностей». М.Корш. Санкт Петербург, издание А. С. Суворина, 1894.) АНТИКЛЕЯ… …   Энциклопедия мифологии

  • Антиклея — (др. греч. Ἀντίκλεια)  в древнегреческой мифологии[1] дочь Автолика. Спутница Артемиды, охотилась вместе с ней[2]. Супруга Лаэрта, мать Одиссея[3]. По одной из версий, она, уже предназначенная в жены Лаэрту, сошлась с гостившим в доме её… …   Википедия

  • Антиклея —          в греч. миф. дочь Автолика, супруга Лаэрта, мать Одиссея, умерла от тоски по долго странств. сыну …   Древний мир. Энциклопедический словарь

  • Антиклея —         в греч. мифологии дочь Автолика, супруга Лаэрта, мать Одиссея; умерла от тоски по долго странствующему сыну …   Словарь античности

  • Антиклея — (греч.)  – мать Одиссея. Скончалась от тоски по сыну во время его странствий и встретилась с ним в Аиде, куда Одиссей спустился живым, чтобы узнать свое будущее от умершего прорицателя Тиресия …   Мифологический словарь

  • Одиссей — Эта страница посвящена древнегреческому мифологическому царю Одиссею. Для просмотра других значений этого имени, обратитесь к статье Одиссей (значения). Одиссей (Όδυσσεύς) Г …   Википедия

  • Одиссей (мифология) — Эта страница посвящена древнегреческому мифологическому царю Одиссею. Для просмотра других значений этого имени, обратитесь к статье Одиссей (значения). Одиссей (Όδυσσεύς) Голова мраморной статуи Одиссея, II век до н. э. Мифология:… …   Википедия

  • Мифы Мессении — Содержание 1 Введение 2 Топонимы 3 Царские династии 3.1 Пилос …   Википедия

  • ГОМЕР — первый из греческих поэтов, чьи произведения дошли до нас, и, по общему признанию, один из величайших европейских поэтов. О нем самом и о его жизни мы не имеем никаких достоверных сведений. Многие города притязали на право зваться родиной поэта,… …   Энциклопедия Кольера

  • Одиссей — (Odysseus, Οδυσσεύς). Царь острова Итаки, греческий герой, участвовавший в Троянской войне и прославившийся своей хитростью и красноречием. Он был сын Лаэрта, муж Пенелопы и отец Телемаха; принял участие в Троянской войне лишь после долгих просьб …   Энциклопедия мифологии

  • Антиклея в ландшафтном дизайне – Дневник садовода gossort68.su

    Сайт о саде, даче и комнатных растениях.

    Посадка и выращивание овощей и фруктов, уход за садом, строительство и ремонт дачи — все своими руками.

    Сюсиринхий и антиклея (фото) – посадка и уход

    Цветы сюсиринхий и антиклея – выращивание, виды и уход

    Эти растения для меня объединяет хрупкость и воздушность облика, похожая на листву злаков настолько, что несведущий народ постоянно путает, и цветки, похожие то ли на снежинки, то ли на шестилучевые крохотные звездочки. Трогательные они – сисюринхий и антиклея.

    СИСЮРИНХИЙ – многолетнее травянистое растение семейства касатиковых (Iridaceae). Название рода древнегреческое и в переводе означает «поросячий пятачок». Старик Теофраст так называл какие-то луковичные растения, близкие к ирисам. Теофраста нет уже много тысяч лет, а название осталось и нашло себе нового хозяина – род некрупных изящных растений американского происхождения. Причем ареал рода растянулся с севера на юг от Гренландии аж до Огненной Земли.

    В садах сисюринхии используются очень давно, некоторые виды даже «убежали из культуры» и встречаются как заносные по всей Европе, и в России в частности.

    ВСЕ ЧТО НЕОБХОДИМО ДЛЯ ЭТОЙ СТАТЬИ НАХОДИТСЯ ЗДЕСЬ >>>

    Короткокорневищные многолетники с зелеными или сизоватыми листьями. Цветки сине-фиолетовые, голубые, желтоватые или красные, реже белые, шестичленные.

    Значительная часть видов чисто тропического происхождения и у нас не зимует. Но те, что зимуют, милы и неприхотливы.

    СИСЮРИНХИЙ

    Сисюринхий узколистный (Sisyrinchium angustifolium). Может встречаться также под названиями Sisyrinchium anceps, Sisyrinchium bermudianum и Sisyrinchium gramineum.

    Произрастает в прериях, на болотах, в трещинах скал от теплоумеренной до субтропической зоны США и Канады, в горах в среднем поясе. Стебель высотой от 25 см до 45 см, простой или ветвистый. Цветки фиолетово-синие с желтовато-белым глазком, диаметром до 2 см, по 1-6 в соцветии. Каждый цветок открыт всего один день, но один сменяет другой в течение остаточно долгого времени. Цветет в начале лета. Есть белая разновидность Album.

    Сисюринхий калифорнийский (Sisyrinchium californicum), может встречаться в литературе как Hydastylus californicus. В природе растет на сырых лугах побережья теплоумеренной и севера субтропической зоны юго-запада США. Стебель высотой до 60 см. Листья совсем узкие, длиной до 30 см и шириной до 0,5 см. Цветки блестяще-желтые, диаметром до 25 мм, по 3-7 в соцветии. Цветет весной. Зимостойкость в условиях средней полосы все же оставляет желать лучшего. Но при условии самосева и если условия подойдут, то он в саду задержится. Это достаточно модная и популярная на Западе штучка для цветников со злаками, которые н е уходят и з тренда уже порядочное количество лет.

    Возможно, перспективными в средней полосе могут оказаться такие виды, как сюсиринхий Дугласа (Sisyrinchium douglasii) с довольно крупными, если так можно сказать о сисюринхии, ярко-красные цветками, сюсиринхий злаколистный (Sisyrinchium graminifolium) с желтыми цветками, сюсиринхий злаковидный (Sisyrinchium graminoides) с голубыми цветками, сюсиринхий вздутый (Sisyrinchium inflatum) с ярко-красными меленькими цветками.

    Сисюринхии в целом неприхотливые растения. Могут расти на любой хорошо дренированной почве, на солнце или в полутени. Но предпочитают богатые гумусом песчаные почвы и солнечное местоположение. Легко размножаются семенами или делением, часто дают самосев и могут сорничать. Если хочется ограничить самосев, то следует срезать цветоносы после цветения.

    Классические места для сисюринхия в саду – это каменистые горки и гравийные сады. Его хорошо выращивать на гравийных отсыпках. Помните, что растение это само по себе по природе недолговечное и продолжительно держаться в культуре будет за счет самосева. А в гравии для него самые благоприятные условия.

    АНТИКЛЕЯ

    АНТИКЛЕЯ (прежде зигаденус) – растение семейства осенниковых, или мелантиевых (Melanthiace-ае), раньше относили к более общему семейству лилейных (Liliaceae). В природе произрастает в Северной Америке, а один вид и в России. Луковичные растения, луковицы одеты в пленочную оболочку, одна оболочка может окутывать сразу несколько луковиц. Цветки в кистевидном или метельчатом соцветии, окраска цветков белая, желтоватая или зеленоватая.

    Наиболее распространена в культуре антиклея изящная (Anticlea elegans). На родине ее ареал доходит до Аляски (поэтому и в наших условиях она абсолютно зимостойка). Растет там по влажным горным лугам и лесам, на каменистых склонах. Растение высотой до 80 см, листья до 30 см в длину и до 1,5 см в ширину. Есть разновидность с сизыми листьями. Цветки зеленоватые снаружи и белые внутри, на них видны блестящие капельки выделений из нектарных железок, которые расположены парами в основании лепестков. Цветет с середины июля.

    Другой распространенный в культуре вид – антиклея нутталля (Anticlea nuttallii). В природе растет в американских прериях, т.е. в высокотравных формациях степного типа, на плодородных почвах, где цветет в весенний период. Высота до 60 см, длина приземистых листьев до 45 см, цветки желтоватобелые, 1,3 см в диаметре, нектарные железки одиночные.

    Антиклея Фремонта (Anticlea fremontii) также входит в число «садовых» видов. В природе произрастает на западе США. Может достигать 1 м в высоту, хотя есть и карликовые формы до 20 см.

    Единственная неамериканская антиклея – антиклея сибирская (Anticlea sibirica). Произрастает в европейской части России, в Сибири, Приморье в редких лесах, зарослях кустарников, в трещинах скал. Высота растения до 80 см, цветки белые, более мелкие, 1 см в диаметре.

    Антиклеи лучше выращивать на плодородных почвах при достаточном увлажнении. Как на солнце, так и в тени растения цветут хорошо.

    Все виды содержат токсичные алкалоиды и сильно ядовиты. Но это не препятствует их выращиванию в садах при соблюдении определенной осторожности, тем более что на самом деле ядовитых растений в наших цветниках много.

    К сожалению, антиклеи медленно нарастают и за счет вегетативного размножения их много не получишь. При этом растение максимально декоративно именно в большой куртине. А поскольку антиклеи не нуждаются в делении для омоложения, то лучше их и не терзать лишний раз.

    Для размножения ранней весной или в начале осени растение лучше выкопать полностью и отделить необходимое количество луковиц. Попытка отделить луковицы от куртины на месте, как правило, приводит к порче соседних луковиц, так как сидят они очень плотно друг к другу.

    Семена не требуют стратификации и могут быть посеяны весной. Всходы появляются при температуре 20° и похожи на всходы сорной травы. Чтобы не спутать их с настоящими сорняками, лучше использовать для посева контейнеры.

    Антиклея легко образует и самосев, но попробуй его отличи от всходов того же настырного, летящего отовсюду вейника, пока они маленькие. Неудивительно, что частенько его выпалывают.

    В первый год нарастание сеянцев очень медленное. На второй год растение уже больше похоже на взрослое. Цветение наступает на 3-4-й год, но хорошая куртина сформируется только лет через 6.

    Антиклея в ландшафтном дизайне

    Одна из красивейших в роде. Произрастает в Северной Америке компактными группами.

    Растение высотой 20 – 100 см, с сизым налетом. Листья линейные, жесткие, длиной 10 – 30 см, шириной 0,4 – 1,5 см, собраны в прикорневые пучки высотой до 60 см. Цветет в начале лета. Цветки многочисленные мелкие желто-зеленые, собраны в метельчатое соцветие на плотном цветоносе высотой около 100 см. Луковицы вытянутые, связанные корневищем.

    Фотографии Константина Александрова

    Зигаденус Нутталля — Z. nuttallii (A. Gray) S. Wats. = Amianthium nuttallii A.Gray = Toxicoscordion nuttallii Rydb.

    Обитает в степной области центральных штатов США. Назван в честь исследователя флоры Запада США Т. Нутталля (Th. Nut-tall, 1786—1859).

    Растения 30—60 см высотой, светло-зеленые, сизоватые. Листья расположены у основания стебля, 0.6—2 см шир., вдоль сложенные, короче стебля, в числе 4—6. Цветки в кистевидном или метельчатом соцветии, белые, до 1.2 см в диаметре; нектарник один, округлый. Цветет в начале лета. Испытан: С-Петербург, Москва.

    Фотография Михаила Полотнова

    Зигаденус сибирский (Антиклея) — Z. sibiricus (L.) A. Gray = Melanthium sibiricum L. = Anticlea sibirica Kunth

    Произрастает в редких лесах, зарослях кустарников, трещинах скал на востоке европейской части России, в Сибири, Амурской области, Приморском и Хабаровском краях и в альпийском поясе гор в Северной Японии.

    Растение высотой 20 – 80 см. Листья у основания стебля линейные, суживающиеся к низу, длиной 10 – 20 см, шириной 0,4 – 1 см. Стеблевых листьев 1 – 2, короткие. Прицветники темно-фиолетовые. Цветки белые, собраны в рыхлую кисть, диаметром 1 см. Наружные доли околоцветника широколанцетные, внутренние ланцетные, нектарники парные, пыльники красновато-фиолетовые. Цветет в июне.

    Фотография Вячеславa Петухинa с сайта «Природа Байкала»

    Зигаденус Фремонта — Zigadenus fremontii (Torrey) Torrey ex S. Watson, Botany (Fortieth Parallel).

    Растет в США (Калифорния, Орегон) и Мексике. Смешанные и вечнозеленые леса на высоте до 1000 м.

    Луковицы до 4 см в диаметре, яйцевидные. Листья до 50 см длиной и 3 см шириной.Соцветие кистевидной или метельчатое несет от 2 до 80 цветочков диаметром до 2,5 см. Цветет в июне.

    Встречаются подвиды:
    Zigadenus fremontii var. minor R. R. Gates
    Zigadenus fremontii var. inezianus Jepson;
    Zigadenus fremontii var. salsus Jepson

    Фотография Чубаковой Алёны

    Месторасположение: предпочитает богатые почвы. Хорошо развивается как в полутени, так и на открытых солнцу местах. Влаголюбива (в природе растет на заливных лугах), но выносит временную пересушку. Зимостойка без укрытия.

    Фотография ЭДСР.

    Размножение: cеменами и вегетативно. При выращивании из семян стратификация не требуется. Сеянцы развиваются медленно. После пикировки молодые растения тревожить не рекомендуется — любые пересадки могут задержать рост или увести растения на преждевременный покой. Для лучшей перезимовки ящики с рассадой необходимо вкопать в землю, замульчировать и прикрыть сухим листом на высоту около 5 см. Наилучший вариант зимовки молодой рассады — хранение в холодном, но не морозном помещении при умеренной влажности почвы. Весной растения высаживают сразу после пробуждения в просторные ящики или в открытый грунт для дальнейшего выращивания. Зацветают на 3-4 год. Вегетативно можно размножить делением рано весной или после отцветания.

    Использование: чрезвычайно стройное элегантное растение. Удивительно хороша при высадке небольшими группами возле камней. Пригодна практически для всех типов каменистых садов, в том числе для “болотца» и миксбордера.

    Антиклея

    Латинское название: Anticlea

    виды «Антиклея»

    Почва
    • Питательная, нейтральная
    Размер
    Время цветения
    • С июля по август
    Возможные расцветки
    Освещенность
    • Средне // Допустимы прямые лучи несколько часов, восточная, западная ориентация
    Полив
    • Средне // Обильный полив 2-3 раза в неделю
    Сложность ухода
    • Мало // Не нуждается в особых требованиях для роста и цветения
    Влажность воздуха
    • Мало // Нетребовательно к влажности водуха
    Частота удобрения
    • Мало // Достаточно питат. веществ из собственной почвы или редкого удобрения

    Содержание

    • 1. Описание
    • 2. Выращивание
    • 3. Болезни и вредители
    • 4. Размножение
    • 5. Первые шаги после покупки
    • 6. Секреты успеха
    • 7. Возможные трудности

    Описание

    До XXI века название Антиклея употреблялось только в качестве синонима. Однако исследования на молекулярном уровне доказали неотъемлемое право на родовую самостоятельность. Род Антиклея практически опустошил ряды рода Зигаденус, попутно забрав большинство видов Стенантиума.

    В наши дни Антиклея — общее наименование 11 видов травянистых многолетников из семейства Мелантиевые. Луковичные растения образуют прикорневую розетку из длинных листьев с заостренными кончиками. Листовые пластины линейной формы окрашены в зеленый цвет с сизоватым оттенком.

    Летом из центра розетки вытягивается цветонос. Стеблевые листочки редкие и маленькие, крепятся к побегу короткими черешками. Высота цветоноса доходит до метра.

    Маленькие цветочки белые, часто с легкой примесью желтого или зеленого тона. Они образуют объемные кистевидные или метельчатые соцветия. Отличительный признак рода — зеленая железа сердцеобразной формы у основания каждого лепестка и чашелистика. Из центра выпирают бело-зеленые тычинки, пыльники которых ближе к концу цветения становятся ярко-желтыми. Запаха цветы не имеют.

    Цветение длится свыше месяца, на исходе лета появляются плоды — коробочки, наполненные мелкими коричневыми семенами.

    Выращивание

    Антиклея — прекрасное растение для оригинальных садовых композиций. Особенно хорошо она смотрится в групповых посадках. Эти представители флоры отлично приживаются у водоемов и на участках с влажной почвой, а также на каменистых горках.

    Окончание цветения не ведет к потере декоративности. Прикорневые листья Антиклеи не отмирают и не сморщиваются. Аккуратная розетка сохраняет привлекательный внешний вид до холодов.

    Все части растения содержат токсины. Мелкие и крупные вредители предпочитают держаться от Антиклеи на расстоянии.

    Эти растения размножают в культуре не только семенами, но и делением куста. Процедуру проводят весной. Каждая деленка должна получить 3–4 луковицы. Очень бережно следует обращаться с корнями, поэтому от использования ножа или ножниц желательно отказаться. После ручного деления отдельные растения высаживают, располагая корневище у поверхности почвы. Молодые Антиклеи поливают чаще и обильнее, чем взрослые экземпляры.

    Болезни и вредители

    Размножение

    Семенами, луковицами, делением куста.

    Первые шаги после покупки

    Антиклею выращивают из луковиц и из семян. При приобретении луковиц надо выбирать плотные, без признаков гнили экземпляры с неповрежденной оболочкой. Высаживают их весной.

    Всхожесть семена Антиклеи теряют очень быстро. Качественным считается посадочный материал исключительно текущего года. Высевают их в контейнеры с плодородной почвой. Ростки всходят медленно и не дружно. После образования 3–4 настоящих листьев необходима пикировка. Лучше использовать торфяные горшочки. В этом случае при пересадке риски повреждения корневой системы значительно снижаются. До весны сеянцы содержат в прохладном помещении. В мае Антиклеи перемещают на отведенное место, подкармливают комплексным минеральным удобрением. Поливают до укоренения часто.

    Секреты успеха

    Антиклея может приспособиться к существованию на освещенных участках. Но наиболее комфортно чувствует себя в полутени.

    Для полноценного развития растению нужен плодородный грунт. На скудных почвах Антиклея не достигает заявленной высоты.

    Кратковременная засуха не наносит вреда здоровью растения. Однако Антиклея с благодарностью отзывается на регулярные умеренные поливы. Воду желательно вливать под розетку, избегая попадание жидкости на листовые пластины.

    Антиклея легко привыкает к температурам воздуха любого региона. В жару нуждается в более частых поливах. Растение отличается морозоустойчивостью. Зимует без укрытия при похолодании до -40°C.

    Возможные трудности

    В силу особенностей строения корневой системы (яйцевидные луковицы связаны корневищем) Антиклея наращивает розетки очень медленно. При выращивании из семян цветение наступает, как правило, на 4 год. Из луковиц — на третий.

    После деления и пересадки растение также берет 1–2-годичный тайм-аут.

    Ядовиты все части Антиклеи. При уходе желательно надевать перчатки и соблюдать меры предосторожности. Особенно аккуратно следует хранить луковицы, содержащие большое количество токсинов. В свое время растение погубило немало коренных индейцев и американских поселенцев из-за сходства подземной части с репчатым луком и вполне съедобными луковицами Камассии.

    При высаживании Антиклеи важно не переусердствовать с заглублением. В противном случае корневая шейка загнивает, что оборачивается преждевременной гибелью растения.

    На ярко освещенных участках цветение оскудевает.

    Подпишитесь и получайте описания новых видов и сортов в разделе «луковичные и клубнелуковичные» на почту!

    Растения для альпийской горки: 4 совета по выбору

    Не один год в саду создаю альпийскую горку, но многолетние растения в ней плохо приживаются. Начала искать, что делаю не так.

    Стала изучать фото и названия, период вегетации и способы посадки. Мои усилия увенчались успехом. Трава заколосилась, цветы зацвели, а кустарники раскинули пышные кроны. Делюсь собранной информацией.

    Сажайте весной или осенью

    Что посадить на солнце:

    1. Большие растения сажать одиночно. На возвышенности альпинария лучше посадить хвойники: голубая ель, туя конифер, можжевельник шарообразный или колоновидный. Высаживать их одиночно, подбирать низкорослые растения, достигающие 40-100 см в высоту.
    2. Разбавлять кустарниками. Чтобы горка привлекала внимание круглый год и играла различными красками высаживать на ней надо низкорослые кустарники и цветы. Идеальным решением будет барбарис, имеющий разнообразный окрас, низкорослые розы и азалии. Все эти растения не боятся солнца и притеняют луковичные.
    3. Между камнями высаживать почвопокровные растения. Для декоративного укрытия почвы между камнями хороши будут почвопокровные растения такие, как: очиток, тимьян, вереск.
    4. Не отказываться от мелколуковичных. Ранней весной украсят горку мелколуковичные цветы: тюльпаны, первоцвет, ландыши и подснежники.

    Эфемероидные виды — самые неприхотливые

    Растения для альпийской горки:

    Хохлатка (CORYDALIS)

    Описание:

    • декоративны;
    • морозоустойчивы;
    • не повреждаются вредителями;
    • быстро размножаются;
    • период цветения: ранняя весна.

    Тень или солнце: неприхотливые растения, способны выживать в различных условиях.

    Агротехника:

    • предпочитают глубокие глинистые или супесчаные почвы с листовым перегноем;
    • не переносят застоя воды, особенно в зимний период;
    • луковицы углублять в землю на 7-10 см.

    После отмирания листьев хорошо переносят сухость почвы

    Мускари или Мышиный гиацинт (MUSCARI)

    Описание:

    • обладают приятным сильным запахом;
    • зимостойки;
    • неприхотливы;
    • цветут 15-25 дней ранней весной.

    Тень или солнце: предпочитают солнечные склоны и полутень.

    Агротехника:

    • не переносят застой влаги в почве;
    • отзывчивы на внесение органических удобрений;
    • компост вносить осенью;
    • в период цветения нуждаются в увлажнении.

    Используются для украшения бордюров, не любят низинные места

    Хионодокса или Снеговик (CHIONODOXA)

    Описание:

    • самыми первыми;
    • цветоносы кистистые с большим количеством соцветий;
    • зимостойки;
    • период цветения: ранняя весна, появляются прямо из под снега.

    Тень или солнце: предпочитают солнечные открытые поляны.

    Агротехника:

    • хорошо приживаются на плодородных почвах;
    • требовательны к хорошо дренированным землям;
    • предпочитают азотные удобрения;
    • частое рыхление земли.

    Лучший период для пересадки растений — конец вегетации

    Все эфемероидные виды хорошо размножаются луковицами-детками и свежими семенами, зацветая на 3-5 год.

    Цветы многолетники

    Используемые при создании альпийских горок:

    Антиклея изящная (Зигаденус) — Anticlea elegans (Zygadenus)

    Описание:

    • многолетний луковичный цветок;
    • узкие сизые листья, собранные в прикорневой пучок;
    • высота 40 см;
    • цветки метельчатые желто-зеленые;
    • цветонос 70 см;
    • цветет в начале лета.

    Тень или солнце: хорошо развивается в полутени и на солнечных участках каменистых садов.

    Агротехника:

    • предпочитает почвы;
    • влаголюбив;
    • луковицы не имеют летнего покоя
    Армерия приморская (А. maritima)

    Описание:

    • травянистое растение, образующее подушки из узких листьев;
    • соцветия головчатые;
    • цветы розовые, высотой 3-30 см; эффекты в узких лунках и между скальниками.

    Тень или солнце: открытые солнечные места.

    Агротехника:

    • не требовательна к почве, но отзывчива на достаточно рыхлую землю;
    • хорошо переносит засуху;
    • устойчива к холодам
    Водосбор вееровидный (A. flabellata)

    Описание:

    • карликовый вид высотой 15 см;
    • листья сизо-зеленые, перистые;
    • цветки крупные, распускаются в начале лета.

    Тень или солнце: растет в полутени и на солнечной стороне.

    Агротехника:

    • лучше живет на легких рыхлых почвах, но может расти и на торфянике; засухоустойчив;
    • легко переносит пересадку;
    • цветет обильно в июне
    Колючник бесстебельный (С. acaulis)

    Описание:

    • жесткие колючие листья собраны в розетки;
    • соцветия в виде корзинок 6-8 см;
    • раскрывается на солнце;
    • сухоцвет.

    Тень или солнце: исключительно солнечные места у камней.

    Агротехника:

    • засухоустойчив;
    • не переносит пересадку;
    • предпочитает некислые рыхлые суглинки;
    • зимостоек;
    • погибает при переувлажнении почвы
    Астра (ASTER)

    Описание:

    • осенние цветы;
    • размножение семенное и вегетативное;
    • не устойчивы к болезням: мучнистая роса, серая гниль, листовая нематода;
    • красиво смотрится в групповых посадках.

    Тень или солнце: хорошо растут на солнечных местах.

    Агротехника:

    • предпочитают хорошо перекопанные плодородные суглинки;
    • размножаются семенами и делением куста;
    • сырые почвы губительны;
    • любят периодическую подкормку калийными и фосфорными удобрениями в период вегетации.

    Пересадку лучше начинать в конце августа и начале сентября

    Мшанка (SAGINA)

    Описание:

    • растения почвопокровные;
    • побеги сильно прижаты к земле;
    • цветет в зависимости от вида с начала лета и до сентября;
    • мох разрастается медленно;
    • образует мягкие зеленые подушки.

    Тень или солнце: обильно цветет на солнечных местах.

    Агротехника:

    • произрастает на песчаных суглинистых местах;
    • от обилия влаги загнивает;
    • не переносит бесснежные холодные зимы;
    • размножается вегетативно и семенами.

    Прекрасное растение для альпинария

    Льнянка (LINARIA)

    Описание:

    • различают как однолетние так и многолетние растения;
    • цветет с июня по сентябрь голубыми цветами с ярко оранжевой губкой;
    • ампельная форма побегов подходит для украшения вертикальных стен;
    • легко переносит морозы.

    Тень или солнце: растет на солнечных каменистых склонах.

    Агротехника:

    • предпочитает скальные песчаные почвы; размножается вегетативно и семенами;
    • цветочная горка с льнянкой не требовательна к поливу;
    • легко переносит засушливые месяцы

    В ландшафтном дизайне многолетники сменяют эфемероидные растения.

    Деревья и кустарники

    Голубая ель в дизайне сада или клумба с можжевельником:

    Можжевельник даурский (Juniperus davurica Pall)

    Описание:

    • стелющиеся растения с серой отслаивающейся корой;
    • хвоя острая;
    • шишкоягоды одиночные, семена в сизых коробочках;
    • применяется для обсадки склонов и альпинариев.

    Тень или солнце: светолюбив, но переносит незначительное затенение.

    Агротехника:

    • засухоустойчив;
    • произрастает на каменистых россыпях, песчаных заносах;
    • размножается семенами, черенками, отводками
    Голубая ель (Pimoko)

    Описание:

    • карликовые растения версии ели Picea omorika Nana;
    • небольшое дерево с плотной шаровидной кроной;
    • голубовато-зеленая хвоя;
    • красно-коричневые почки;
    • подходит для среднего альпинария;
    • дает прирост 7 см в год;
    • десятилетнее дерево не превышает 30 см.

    Тень или солнце: требовательна к освещению.

    Агротехника:

    • почва: дерновая, листовая, песок, торф в соотношении 2:2:1:1;
    • не терпит близости грунтовых вод;
    • нуждается в умеренном поливе;
    • хорошо переносит обрезку;
    • молодые растения на зиму прикрывать нетканым материалом;
    • размножается семенами
    Барбарис (BERBERIS)

    Описание:

    • красивые листопадные вечнозеленые кустарники;
    • декоративны;
    • используются в одиночных и групповых посадках;
    • медонос;
    • внешний вид зависит от сорта;
    • период цветения выпадает на май-июнь;
    • для каменных садов выбирают растения высотой не более 50 см.

    Тень или солнце: любит открытые солнечные территории.

    Агротехника:

    • предпочитает нейтральную почву;
    • подкормка азотными удобрениями со 2 года жизни;
    • размножается семенами, черенками, делением куста;
    • хорошо переносит стрижку, оптимальный период конец июня, начало августа.

    Как дополнение к барбарису хороша каменная роза

    Деревья и кустарники для альпийских горок подбираются не только по размерам, но и видам и сортам.

    Средняя альпийская горка

    Схема со списком растений:

    Каменистые горки цветущие все лето остаются привлекательными с хвойниками зимой Яркие почвопокровники подчеркивают красоту камней

    Антиклеи для ухода за стомой

    Иногда пациенты думают, что покраснение, болезненность, раздражение кожи (от частой смены пластин и контакта кожи с выделениями из стомы) – явление нормальное и неизбежное. Однако все это можно предотвратить, используя различные профилактические и лечебные средства по уходу за кожей вокруг стомы или фистулы, а также на участках тела, подверженных воздействию мочи или каловых масс.

    Современные средства по уходу за кожей и антиклеи не только помогут избежать повреждений кожи, но и способствуют заживлению, устраняют дискомфорт, оказывают антибактериальное и смягчающее действие.

    В нашем интернет магазине можно купить антиклеи и очистители кожи вокруг стомы ведущих компаний производителей: Coloplast, Hollister, Convatec, Trio и т.д.

    Применение антиклея для стомы

    Антиклей применяется для удаления пластин и очистки кожи от адгезивных веществ. Он помогает в считанные секунды безболезненно удалить пластину и остатки клея, быстро высыхает и не препятствует фиксации новой пластины. Это хорошее профилактические средство, помогающее избежать травмирование кожи из-за постоянного удаления пластин. Содержащиеся в антиклее вещества увлажняют, смягчают и готовят кожу к замене пластины.

    Антиклей не содержит токсических и вредных веществ. Он оказывает деликатное воздействие на кожу, поэтому идеально подходит для людей с такими проблемами как контактный дерматит, покраснение, мацерация.

    Для наилучшего приклеивания адгезивных пластин производители рекомендуют очищать кожу специальными очистительными средствами или нейтральным мылом с водой. Очистительные средства прекрасно заменяют мыло, они облегчают и ускоряют процесс очистки кожи, нейтрализуют неприятные запахи, удаляют остатки клея, каловых масс, слизи. В отличие от мыла, средства по уходу не сушат кожу и оказывают превосходное антибактериальное, разглаживающее и смягчающее действие, способствуют быстрому заживлению поврежденной кожи. Их используется для обработки и очищения поверхности тела вокруг стомы или фистулы, участков подверженных воздействию мочи или каловых масс при недержании.

    В нашем магазине очистительные средства представлены в большом ассортименте и в различных видах: спреи, влажные салфетки, растворы и др. Все эти средства могут применяться для ухода за лежачими больными.

    Применение антиклея для стомы

    Салфетки очищают кожу от остатков адгезивных веществ, увлажняют и смягчают ее, предохраняя кожу от вероятных раздражений и повреждений. Их можно брать собой, они удобны в применение и позволяют быстро, легко и комфортно очистить зону стомы в любом удобном для Вас месте.

    Приобретайте себе в помощь антиклеи и очистители для кожи, освободитесь от лишних беспокойств и проблем и идите по жизни уверенным шагом!

    Иглы для вышивальных машин с антиклеевым покрытием Super NonStick для вышивальных машин – Размер 75/11


    • Эта запатентованная игла Anti-Glue (также обозначаемая как LP для Lubricant Plating) имеет специальное покрытие, которое препятствует образованию липких отложений, связанных с липкой поверхностью и спреями для наметки.Это тонкое покрытие помогает уменьшить обрывы ниток, связанные с липким налетом.
    • Игла LP разработана для вышивания и имеет такую ​​же форму и свойства иглы, как и игла для вышивания, и обладает дополнительным преимуществом в виде специального покрытия.
    • 5 игл в упаковке, размер 75/11 – Альтернативная система игл: 130 / 705H, 15X1ST, HAX1ST
    • Для вышивания на большинстве тканей и специальных вышивальных ниток, особенно подходит для липкой связки и наметочных аэрозолей.
    • Легкое острие и уникальный шарф позволяют лучше формировать стежки и контролировать их в нескольких направлениях.

    # 75/11 Иглы для вышивания с защитой от приклеивания | SuperiorThreads.com

    # 75/11 Иглы для вышивания с защитой от приклеивания | SuperiorThreads.com

    НАСЛАЖДАЙТЕСЬ БЕСПЛАТНОЙ ДОСТАВКОЙ НА ЗАКАЗЫ НА 50 $ ИЛИ БОЛЕЕ (ПО АДРЕСАМ США)

    Иглы » Иглы для домашних машин » # 75/11 Иглы для вышивания с антиклеевым покрытием

    6 долларов.99

    Эта запатентованная игла Anti-Glue (также обозначаемая как LP для Lubricant Plating) имеет специальное покрытие, которое препятствует образованию липких отложений, связанных с липкой поверхностью и спреями для наметки. Это тонкое покрытие помогает уменьшить обрывы нити, связанные с липким налетом.
    Игла LP разработана для вышивания и имеет такую ​​же форму и свойства иглы, как и игла для вышивания, и обладает дополнительным преимуществом в виде специального покрытия.
    Размер: # 75/11
    Кол-во: 5 игл

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Антиадгезивная активность биоповерхностно-активного вещества псевдофактина II, секретируемого арктической бактерией Pseudomonas fluorescens BD5 | BMC Microbiology

    Микроорганизмы и условия культивирования

    P.fluorescen s Штамм BD5 был получен из пресной воды Арктического архипелага Шпицберген [19] и поддерживался на среде минеральных солей MSM (7 г / лK 2 HPO 4 , 2 г / л KH 2 PO 4 , 1 г / л (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,5 г / л цитрата натрия 2H 2 O и 0,1 г / л MgSO 4 .7H 2 O) с 2 % D-глюкозы.

    Антимикробные и антиадгезивные свойства псевдофактина II были протестированы на нескольких патогенных штаммах, которые колонизируют желудочно-кишечный тракт или медицинские устройства животных. E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 10536, E. coli 17 2 (клинический изолят, Вроцлавский медицинский университет), E. faecalis ATCC 29212, E. faecalis JA / 3 (клинический изолят, Вроцлавский медицинский университет), E. hirae ATCC 10541, S. epidermidis KCTC 1917 [20], P. mirabilis ATCC 21100 выращивали при 37 ° C и V. harveyi ATCC 14126 , V. ordalii KCCM 41669 выращивали при 28 ° C в среде LB (10 г / л бакто-триптона, 5 г / л экстракта бакто-дрожжей, 10 г / л NaCl).Два штамма грибов, C. albicans ATCC 20231 и C. albicans SC5314 [21], выращивали в дрожжевой азотной основе с концентрацией 6,7 г / л (YNB, pH 5,5), бульоне (Difco Laboratories), содержащем 2% D- глюкоза для тестов на адгезию. Чтобы предотвратить филаментацию C. albicans , прекультуру инкубировали при 28 ° C, а эксперименты с биопленками проводили при 37 ° C. Среду RPMI-1640 (Cambrex, Verviers, Бельгия) использовали для образования биопленок Candida .

    Выделение и очистка псевдофактина II

    Псевдофактин II производства P.fluorescens BD5 получали экстракцией бесклеточного супернатанта этилацетатом и выпариванием экстракта в вакууме. Неочищенное биосурфактант разделяли с помощью RP-HPLC таким же образом, как сообщалось ранее [19]. Очищенную фракцию псевдофактина II сушили и хранили при -20 ° C для дальнейших исследований. Аналитическая ОФ-ВЭЖХ (данные не показаны) очищенного псевдофактина II показала, что его чистота была> 99%.

    Антимикробные анализы

    Антимикробную активность изолированного псевдофактина II определяли методом микроразбавления в 96-луночных плоскодонных пластиковых микропланшетах (Sarstedt, Nümbrecht, Германия).Вкратце, 50 мкл объемов стерильной среды LB (для бактерий) или YNB (для дрожжей) двойной концентрации распределяли в лунки 96-луночного микропланшета. Затем в лунки микропланшета добавляли 50 мкл раствора псевдофактина II (0,035-0,5 мг / мл) в фосфатно-солевом буфере (PBS) и смешивали со средой. Отрицательные лунки и лунки с контролем роста не содержали биоповерхностно-активного вещества. Все лунки (за исключением отрицательных контролей) инокулировали 2 мкл ночных бактериальных или дрожжевых культур (разведенных до OD 600 = 0.1) в среде LB или YNB соответственно, и микропланшеты инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C или 28 ° C для бактериальных или дрожжевых культур соответственно. После 24 ч инкубации оптическую плотность при 600 нм каждой лунки измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов Asys UVM 340 (Biogenet). Процент ингибирования роста при различных концентрациях псевдофактина II для каждого микроорганизма рассчитывали как:

    % ингибирования роста = 1-ODTODC × 100

    , где OD T представляет собой оптическую плотность лунки с данной концентрацией псевдофактина II и OD C – оптическая плотность контрольной лунки (рост без псевдофактина II).Анализы проводили трижды в трех повторностях.

    Предварительная обработка псевдофактином II

    Ингибирование микробной адгезии псевдофактином II тестировали в 96-луночных планшетах (Sarstedt, Nümbrecht, Германия). Вкратце, лунки стерильного 96-луночного планшета с плоским дном заполняли 100 мкл 0,035-0,5 мг / мл псевдофактина II, растворенного в PBS. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C на роторном шейкере (MixMate, Eppendorf, Гамбург, Германия) при 300 об / мин, а затем дважды промывали PBS.Лунки отрицательного контроля (холостые) содержали псевдофактин II в наивысшей испытанной концентрации (0,5 мг / мл), тогда как лунки положительного контроля содержали только буфер PBS. Ночные культуры микробных штаммов центрифугировали, дважды промывали PBS (pH = 7,4) и повторно суспендировали в PBS до оптической плотности OD 600 = 1,0 для бактерий и OD 600 = 0,6 для штаммов Candida . Наивысшая адгезия без псевдофактина II наблюдалась при этих оптических плотностях (данные не показаны).Добавляли аликвоту промытой микробной суспензии 100 мкл и инкубировали в лунках. После 2 ч инкубации при 37 ° C на роторном шейкере (MixMate, Eppendorf, Гамбург, Германия) при 300 об / мин неприлипающие клетки удаляли тремя промывками PBS. Затем планшеты окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 5 мин и снова трижды промывали PBS. Прилипшие микроорганизмы были проницаемы, и краситель повторно растворили с помощью 150 мкл изопропанола-0,04 н. HCl и 50 мкл 0,25% SDS на лунку. Показания оптической плотности кристаллического фиолетового для каждой лунки снимали при 590 нм на микропланшете Asys UVM 340 (Biogenet).Псевдофактин II не влиял на абсорбцию отрицательного контроля (кристаллический фиолетовый в холостых лунках). Ингибирование микробной адгезии рассчитывали как ингибирование роста. Анализы проводили трижды в трех повторностях.

    Постадгезионная обработка псевдофактином II

    96-луночные планшеты с плоским дном инкубировали в течение 2 ч на роторном шейкере (MixMate, Eppendorf, Гамбург, Германия) при 300 об / мин со 100 мкл бактериальной суспензии (OD 600 = 1.0) и Candida суспензия (OD 600 = 0.6) в PBS при 37 ° C. Неприкрепленные микробные клетки удаляли трехкратным промыванием лунок PBS. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл 0,035-0,5 мг / мл псевдофактина II и инкубировали при 37 ° C в течение 2 ч на роторном шейкере (MixMate, Eppendorf, Гамбург, Германия) при 300 об / мин. Контрольные лунки содержали только PBS. Планшеты трижды промывали, прилипшие клетки фиксировали 100 мкл 0,1% кристаллического фиолетового в течение 5 мин и снова трижды промывали PBS. Прилипшие микроорганизмы были проницаемы, и краситель повторно растворили с помощью 150 мкл изопропанола-0.04 N HCl и 50 мкл 0,25% SDS на лунку. Оптическую плотность кристаллического фиолетового в каждой лунке измеряли при 590 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Анализы проводили трижды в трех повторностях. Процент удаления микробной адгезии при различных концентрациях псевдофактина II для каждого микроорганизма был рассчитан как:

    % ингибирования роста = 1-ODTODC × 100

    , где OD T представляет собой оптическую плотность лунки с данной концентрацией псевдофактина II и OD C оптическая плотность контрольной лунки (без псевдофактина II).Анализы проводили трижды в трех повторностях.

    Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

    Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) была использована для визуализации образования бактериальных биопленок и Candida биопленок в отсутствие или в присутствии псевдофактина II (конечная концентрация 0,25 мг / мл) в культуральной среде. Бактериальные и дрожжевые биопленки формировались на пластиковых покровных стеклах Thermanox (Nalgen Nunc International Co., Рочестер, штат Нью-Йорк), стеклянных микроскопических покровных стеклах (Menzel-Glaser, Германия) и сегментах силиконовых уретральных катетеров (Unomedical, Дания), помещенных в лунки 24-луночных тарелки (Nalgen Nunc International Co., Rochester, NY), содержащий среду LB для бактерий и среду RPMI-1640 для дрожжей. Инокуляты готовили следующим образом: 24-часовые ночные культуры собирали и повторно суспендировали в нормализованных разведениях (OD 600 = 0,01). В лунки с покровными стеклами вводили 500 мкл инокулята и инкубировали 24 ч при 37 ° C. По истечении этого времени покровные стекла промывали PBS в течение 15 мин. Затем бактериальные биопленки окрашивали в течение 30 мин при 37 ° C 1 мл 0,6% красителя Live / Dead BacLight (Molecular Probes, Eugene, OR), растворенного в PBS, и PBS-содержащего конканавалина A-Alexa Fluor 488 (Molecular Зонды, Евгений, ИЛИ) конъюгированные (0.025 мг / мл) для биопленок Candida . Окрашенные биопленки визуализировали с помощью CLSM с помощью микроскопа Olympus FluoView 500 (Olympus Optical Co. Ltd., Япония). В CLSM использовался лазер на ионах аргона с длиной волны 480–490 нм для возбуждения и полосовой фильтр 500–635 нм для излучения. Изображения CLSM обрабатывались с помощью программного обеспечения Olympus FluoView 500. Анализы проводили два раза. Типичные изображения представлены на рисунке 1.

    Рисунок 1

    Изображения, полученные с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, образования биопленки на полистироле, стеклянных микроскопических покровных стеклах и фрагмента силиконовых уретральных катетеров, вырезанных различными бактериальными штаммами: ((A, I, R) Escherichia coli ATCC 25922, (B, J, S) Enterococcus faecalis ATCC 29212, (C, K, T) Enterococcus hirae , LCC 10541, L , U) Candida albicans SC5314) и ингибирование биопленки после инкубации с псевдофактином II (0.25 мг / мл) в питательной среде: (E, M, W) Escherichia coli ATCC 25922, (F, N, X) Enterococcus faecalis ATCC 29212, (G, O , Y) Enterococcus hirae ATCC 10541, (H, P, Z) Candida albicans mμSC5314) . Масштабные линейки: 50 мкл.

    Образование биопленок в уретральных катетерах

    Уропатогенные штаммы E. coli, E. faecalis, E.hirae и C. albicans . Десять микролитровых объемов ночных культур E. coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 29212, E. hirae ATCC 10541 добавляли в 1000 мкл свежей среды LB и такой же объем C. albicans SC5314 добавляли в 1000 мкл свежей среды RPMI-1640. К среде добавляли 1000 мкл раствора псевдофактина II (конечная концентрация 0,25 мг / мл) в среде LB (для бактерий) и среде RPMI-1640 для ° C.albicans и сегменты стерильных силиконовых уретральных катетеров длиной 4 см (Unomedical, Дания). Катетеры инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Культуры удаляли, а катетеры промывали дистиллированной водой. После промывки в катетеры добавляли 3000 мкл кристаллического фиолетового (0,1%) на 20 мин. Окрашенные биопленки трижды промывали дистиллированной водой и оставляли сушиться при комнатной температуре в течение 15 мин перед исследованием. В параллельном эксперименте катетеры предварительно обрабатывали псевдофактином II, помещая их в пробирку с 2000 мкл 0.25 мг / мл псевдофактина II растворяли в PBS, инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C и затем дважды промывали PBS. Затем эксперимент проводили, как и в случае добавления псевдофактина II в питательную среду. Анализы проводили два раза. Репрезентативные изображения представлены на Фигуре 2. Этот эксперимент проводился в динамических условиях с использованием перистальтического насоса, где поток культуры с псевдофактином II или без него через уретральные катетеры составлял 50 мл / ч.

    Рисунок 2

    Псевдофактин II подавляет образование биопленки на силиконовых уретральных катетерах .Организмы выращивали в течение ночи при 37 ° C в пробирке со стерильными уретральными катетерами, содержащими среду (A) с псевдофактином II и без него 0,25 мг / мл и (B), где уретральные катетеры предварительно инкубировали с биоповерхностно-активным веществом в концентрации 0,25 мг. / мл, как описано в тексте. Биопленки визуализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым.

    Контактная система: модулятор сосудистой биологии с антикоагулянтными, профибринолитическими, антиадгезивными и провоспалительными свойствами | Кровь

    Система КАЛЛИКРЕИН-КИНИН была впервые признана протеолитической системой плазмы и тканей, ответственной за высвобождение вазоактивного провоспалительного медиатора брадикинина (ВК).1 BK, нонапептид, высвобождаемый из кининогенов калликреинами, может воспроизводить многие характеристики воспалительного состояния, такие как изменения местного кровяного давления, отек и боль, что приводит к расширению сосудов и повышенной проницаемости микрососудов. В 1975 году у трех человек был описан дефицит высокомолекулярного кининогена (HK), предшественника BK, у всех из которых было пролонгированное активированное частичное тромбопластиновое время (APTT), тест скрининга поверхностно-активированных белков свертывания крови.2-4 Несмотря на то, что ни у одного из этих людей не было геморрагического состояния, исследования калликреин-кининовой системы плазмы были сосредоточены на определении прокоагулянтных свойств HK. Фактически, уже было известно, что дефицит двух зимогенов, фактора XII и прекалликреина, необходимых для ферментативного расщепления HK, также не приводит к кровотечению. Эти белки плазмы вместе были сгруппированы как контактная система, потому что они требовали контакта с искусственными отрицательно заряженными поверхностями для активации зимогена.За последние 20 лет было показано, что эти белки мало влияют на гемостаз. Однако изучение их молекулярных, биохимических, биологических и физиологических свойств показало, что эти белки взаимодействуют с рядом физиологических и патофизиологических систем. Клонирование и определение их взаимосвязей между структурой и функцией показало новые активности этих белков, такие как ингибирование протеаз, функция антитромбина и антиадгезивные свойства. Их специфические взаимодействия с биологическими мембранами эндотелиальных клеток, тромбоцитов, нейтрофилов и моноцитов указывают на то, что сборка и активация этой системы происходит в физиологической среде, независимо от отрицательно заряженных поверхностей.Фактически, правильно сказать, что так называемая неуловимая физиологическая отрицательно заряженная поверхность для активации контактной системы на самом деле является сборкой этих белков на клеточных мембранах. In vivo отрицательно заряженная поверхность не нужна для активации. Кто-то может возразить, что термин «контактная активация» – неправильный термин для описания этой системы. Белки системы контакта с плазмой обладают антикоагулянтной, профибринолитической, антиадгезивной и провоспалительной функциями. В этом обзоре представлен обновленный взгляд на контактную систему как на физиологический медиатор биологии сосудов и воспалительных реакций.Сначала мы рассмотрим текущие знания о структуре и функциях каждого из белков системы: HK, прекалликреина и фактора XII. Далее мы опишем, как эта система собирается на клеточных мембранах. Участие этих белков в различных биологических действиях (например, регуляция артериального давления, ингибирование активации тромбина клеток, клеточный фибринолиз и антиадгезия) затем будет охарактеризовано с точки зрения их сборки и активации на клеточных мембранах. Кроме того, мы опишем как клинические примеры, так и экспериментальные модели, в которых эта система активирована.Цель этого обзора – прояснить вклад этой системы в физиологические и патофизиологические реакции сосудистой биологии. Наконец, эта презентация укажет на возможные новые терапевтические стратегии для лечения различных заболеваний, возникающих на основе знания этой системы в физиологических и патофизиологических состояниях.

    Экспрессия и регуляция генов . Две формы кининогенов плазмы, HK и низкомолекулярный кининоген (LK), являются продуктами одного гена.5,6 Этот ген отображается на 3q26-qter, где находится гомологичный α 2 HS-гликопротеин и богатый гистидином гликопротеин. 7-9 Один ген кининогена из 11 экзонов, состоящих из 27 т.п.н., продуцирует уникальную мРНК для HK и LK путем альтернативного сплайсинга (рис. 1) .6 HK и LK разделяют кодирующую область первых девяти экзонов, часть экзона 10, содержащую последовательность BK, и первые 12 аминокислот после карбоксиконцевой последовательности BK. Экзон 11 кодирует уникальную легкую цепь длиной 4 кДа LK. Полный экзон 10 содержит полную кодирующую последовательность уникальной легкой цепи 56 кДа HK.Новый механизм альтернативного процессинга РНК был охарактеризован в гене кининогена крысы.10 Эффективность сплайсинга контролируется взаимодействием малых ядерных рибонуклеопротеидов U1 и дополнительных повторяющихся последовательностей малой ядерной РНК (мяРНК) U1 пре-мРНК кининогена. Размер мРНК для LK и HK составляет 1,7 и 3,5 т.п.н. соответственно.

    Рис. 1.

    Доменная структура кининогенов. Кининогены продуцируются одним геном с 11 экзонами (E1-E11).E1-E3 кодирует домен 1 (D1) как на HK (высокомолекулярный кининоген), так и на LK (низкомолекулярный кининоген). Части домена 1 ингибируют предсердный природный фактор. E4-E6 кодирует домен 2 (D2), который содержит папаин и уникальные ингибирующие последовательности кальпаина. E7-E9 кодирует домен 3 (D3), который имеет последовательности, ингибирующие папаин. Домен 4 (D4) кодируется частью E10; это последовательность брадикинина кининогенов и первых 12 аминокислот легких цепей HK и LK. Остальная часть E10 кодирует легкую цепь HK, которая состоит из домена 5 (D5 H ) и домена 6 (D6 H ).D5 H представляет собой область связывания с искусственной поверхностью; D6 H имеет области связывания прекалликреина и фактора XI. Домены 3, 4 и 5 на HK также участвуют в связывании клеток. E11 кодирует остаток уникальной легкой цепи LK (D5 L ).

    Рис. 1.

    Доменная структура кининогенов. Кининогены продуцируются одним геном с 11 экзонами (E1-E11). E1-E3 кодирует домен 1 (D1) как на HK (высокомолекулярный кининоген), так и на LK (низкомолекулярный кининоген).Части домена 1 ингибируют предсердный природный фактор. E4-E6 кодирует домен 2 (D2), который содержит папаин и уникальные ингибирующие последовательности кальпаина. E7-E9 кодирует домен 3 (D3), который имеет последовательности, ингибирующие папаин. Домен 4 (D4) кодируется частью E10; это последовательность брадикинина кининогенов и первых 12 аминокислот легких цепей HK и LK. Остальная часть E10 кодирует легкую цепь HK, которая состоит из домена 5 (D5 H ) и домена 6 (D6 H ). D5 H представляет собой область связывания с искусственной поверхностью; D6 H имеет области связывания прекалликреина и фактора XI.Домены 3, 4 и 5 на HK также участвуют в связывании клеток. E11 кодирует остаток уникальной легкой цепи LK (D5 L ).

    Молекулярная основа одного из примеров гомозиготной недостаточности общего кининогена, признак Вильямса, была определена.11 Произошел переход от AC к T в нуклеотиде 587, в результате чего кодон CGA (Arg) изменился на мутацию TGA (Stop) в экзоне 5, что привело к предотвращению синтеза как HK, так и LK.11 Фенотип этого дефекта подобен фенотипу, наблюдаемому у крыс линии Brown-Norway, Katholiek, у которых отсутствуют кининогены плазмы, но дефект у крыс вызван единственной точечной мутацией Ala 163 в Thr, которая приводит к дефектному секреция из печени.12 Мало что известно о том, что регулирует экспрессию генов кининогенов. У крыс овариэктомия приводит к снижению транскриптов кининогена в печени, тогда как эстрогены повышают уровни мРНК кининогена.13 Этот результат согласуется с клиническим наблюдением, что концентрация HK увеличивается во время беременности.14 Напротив, лечение прогестероном снижает экспрессию гена кининогена, что приводит к небольшому снижению уровней кининогена в плазме.15 Фибробласты мыши синтезируют и секретируют кининогены в ответ на циклический АМФ, форсколин, простагландин E 2 и фактор некроза опухоли α.15 Сходным образом, фактор некроза опухоли α, как было установлено, увеличивает экспрессию кининогена в клетках HEP G2.16 Мало что еще известно о влиянии на уровни кининогена, только потому, что этот аспект кининогенов не был широко изучен.

    Химия белков и структура кининогенов . Две мРНК кининогенов кодируют два отдельных белка. LK представляет собой β-глобулин массой 66 кДа с концентрацией в плазме 160 мкг / мл (2,4 мкмоль / л) и изоэлектрической точкой 4,7,17,18. HK представляет собой α-глобулин массой 120 кДа с концентрацией в плазме 80 мкг. / мл (0,67 мкмоль / л) и изоэлектрическая точка 4.3.18,19 Печень человека является источником кДНК для обоих кининогенов, 5,6 но эндотелиальные клетки пупочной вены человека содержат мРНК HK и синтезируют белок. .20 Антиген кининогена также был обнаружен в тромбоцитах, гранулоцитах, клетках почечных канальцев и коже. 19-24 LK до своего клонирования был также известен как ингибитор α 1 -цистеиновой протеазы.25 И HK, и LK состоят из шаровидные единицы. LK-гель фильтрует при 66 кДа и ведет себя как настоящий глобулярный белок; HK, хотя и 120 кДа, гелевые фильтры на 220 кДа, что указывает на высокое осевое отношение. Физические доказательства того, что HK представляет собой комплекс глобулярных единиц, было получено с помощью электронно-микроскопических исследований. 26 На электронной микроскопии HK представлял собой линейный массив из трех связанных централизованных глобулярных областей с двумя тонко связанными концами.26 Расщепление HK калликреином плазмы приводит к поразительному изменению конформации HK. Центральная глобулярная область отделяется после высвобождения брадикинина и перестраивается с областью, ингибирующей цистеиновые протеазы, противоположной области связывания прекалликреина. 26 Области кининогенов делятся на домены (Рис. 1). Разделение этих доменов представляет собой чувствительные к сериновой протеазе области 27–29. Как будет обсуждаться ниже, смежность определенных доменов важна для некоторых биологических функций кининогенов, таких как ингибирование кальпаина и связывание HK и LK с эндотелиальными клетками.30-32 С другой стороны, протеолитическое расщепление HK выявляет новую функцию, то есть его клеточную антиадгезивную активность.33 Конечно, основная активность кининогенов, которая заключается в доставке брадикинина, – это запрограммированное разрушение белка, потому что брадикинин не активен как биологический пептид, если он не высвобождается из его предшественника.

    Доменная структура кининогенов . Кининогены представляют собой белки, состоящие из нескольких доменов, каждый из которых имеет ассоциированную активность (рис. 1).Связывание кининогена с его клеточными рецепторами способствует высвобождению брадикинина в ограниченной среде, в которой пептид может связываться с рецепторами брадикинина и влиять на местную клеточную среду. Таким образом, можно рассматривать каждую функцию доменов кининогенов как участие в активности доставки кининов целого белка. Кининогены, в общем, можно разделить на три части: тяжелая цепь, которая является общей для HK и LK, фрагмент брадикинина и легкие цепи, которые, как уже говорилось, являются уникальными для HK и LK, соответственно (рис. ).Домены с 1 по 3 составляют тяжелую цепь кининогенов. Домен 4 – это брадикининская область. Домен 5 для LK (D5 L ) представляет собой его уникальную легкую цепь длиной 4 кДа. Домены 5 и 6 HK (D5 H или D6 H ) уникальны для этого белка и включают его легкую цепь.

    Мало что известно о функции домена 1, за исключением того, что он имеет сайт связывания кальция с низким сродством, роль которого неизвестна.34 Хотя ионы кальция важны для активации форбола 12-миристата 13-ацетата LK и связывания тяжелых цепей с эндотелиальными клетками, 35 нет убедительных доказательств того, что ионы кальция участвуют в связывании HK с клетками, 31,36 вопреки данным других лабораторий. .37,38 Недавние данные также показывают, что пептид из домена 1 ингибирует предсердный природный пептид.39 Домены 2 и 3 содержат высококонсервативную аминокислотную последовательность QVVAG, обнаруженную в ингибиторах цистеиновых протеаз (рис. 2) .27 И LK, и HK являются мощные, прочно связывающиеся, обратимые ингибиторы цистеиновых протеаз с K i s 2 и 0.5 нмоль / л кальпаина тромбоцитов, соответственно.18,40 Область ингибирования кальпаина кининогенов обнаруживается исключительно в домене 2 28,30,40,41 , тогда как папаин и катепсин L эффективно ингибируются областями на обоих доменах 2 и 3.27,30,42,43 Компьютерные трехмерные модели домена 2 были построены с использованием рентгеновских кристаллографических координат цистатина, который на 50% идентичен доменам 2 и 3,30. Пептиды из домена 2 HK были отобраны и окислены воздухом с образованием петли с дисульфидной связью.Пептид, содержащий Q 170 VVAG 174 , блокировал HK-ингибирование кальпаина и, таким образом, функционировал как сайт связывания (фиг. 2). Другой пептид (C211-C229), С-конец по отношению к этому пептиду, был прямым ингибитором кальпаина (IC 50 = 35 мкмоль / л). Эти две области, вероятно, образуют непрерывный сайт связывания в трехмерной структуре кининогенов (рис. 2). Третий пептид (V128-L138), N-концевой по отношению к области QVVAG, ингибировал папаин, но не кальпаин, что указывает на то, что сайты ингибирования в домене 2 для этих двух цистеиновых протеаз не идентичны (рис. 2).Напротив, для оптимального ингибирования катепсина B и H требуются три петли домена 3 (рис. 2) .43 Несмотря на то, что они являются ингибитором цистеиновых протеаз, кининогены также являются субстратами этого класса ферментов при молярном избытке фермента по отношению к ингибитору18. , 44,45 Поскольку кининогены являются внеклеточными или находятся внутри гранул в тромбоцитах и ​​гранулоцитах, было неясно, как они взаимодействуют с клеточными цистеиновыми протеазами, которые, по большей части, находятся на внутренней мембране или в цитозоле. тромбоциты активируются, кальпаин перемещается к внешней мембране, в которой он может быть ингибирован плазмой или внешней α-гранулой тромбоцитов HK.45-47

    Рис. 2.

    Структура высокомолекулярного кининогена. Диаграмма аминокислотной последовательности высокомолекулярного кининогена. Круг с тонкими вертикальными линиями обозначает область подавления папаина. Круг с тонкими горизонтальными линиями представляет собой область ингибирования кальпаина. Круг со сплошным фоном представляет собой связывающий домен на клеточной поверхности. Круг с толстыми вертикальными линиями представляет перекрывающуюся активность ингибирования папаина и активность связывания с клеточной поверхностью.Круг с толстыми горизонтальными линиями представляет брадикинин. Круг с пустым фоном представляет домен связывания фактора XI. Круг с заштрихованным фоном представляет собой перекрывающийся прекалликреин и связывающий домен фактора XI.

    Рис. 2.

    Структура высокомолекулярного кининогена. Диаграмма аминокислотной последовательности высокомолекулярного кининогена. Круг с тонкими вертикальными линиями обозначает область подавления папаина. Круг с тонкими горизонтальными линиями представляет собой область ингибирования кальпаина.Круг со сплошным фоном представляет собой связывающий домен на клеточной поверхности. Круг с толстыми вертикальными линиями представляет перекрывающуюся активность ингибирования папаина и активность связывания с клеточной поверхностью. Круг с толстыми горизонтальными линиями представляет брадикинин. Круг с пустым фоном представляет домен связывания фактора XI. Круг с заштрихованным фоном представляет собой перекрывающийся прекалликреин и связывающий домен фактора XI.

    Домен 3 кининогенов выполняет другие функции.Обнаружение того, что LK и его изолированная тяжелая цепь связываются с тромбоцитами и эндотелиальными клетками, указывает на то, что на тяжелой цепи кининогенов имеется участок связывания клеток.35,48,49 Этот момент был подтвержден прямыми исследованиями с использованием изолированного и рекомбинантного домена 3, который содержал область связывания клеток тяжелой цепи на тромбоцитах50 и нейтрофилах.51 Используя компьютеризированную модель домена 3, также основанную на структуре кристаллизованного цистатина, 52 была нарисована последовательная аминокислотная структура домена 3, чтобы показать три открытых участка: дисульфидная петля, соединяющая он к домену 2 и двум шпилькам (рис. 2).Область, ингибирующая цистеинпротеазу домена 3, состоит из частей этих трех открытых петель. Используя синтетические пептиды этих открытых участков, K 244 ICVGCPRDIP 254 (KIC11), N 276 ATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFI 301 (NAT26), исследования L EV10KIY- (NAT26) и L EV10KIYPNA2 DCWNC1 DCWNT были выполнены, чтобы определить, ингибируют ли они связывание HK с эндотелиальными клетками. KIC11, NAT26 и LDC27 ингибировали связывание биотина-HK с эндотелиальными клетками с IC 50 , равным 1000, 258 и 60 мкмоль / л соответственно.Минимальная последовательность в LDC27 для ингибирования связывания составляла 13 аминокислот, C 333 NAEVYVVPWEKK 345 (IC 50 = 113 мкмоль / л) .53 Поскольку папаин блокировал связывание HK с эндотелиальными клетками, сайт ингибирования цистеиновой протеазы перекрывается с сайт связывания клетки в домене 3.53 Таким образом, последние 27 аминокислот домена 3, которые примыкают к домену 4, области брадикинина, являются сайтом связывания эндотелиальных клеток. Тромбоспондин (TSP), белок α-гранул тромбоцитов, секретируемый при стимуляции тромбоцитов, также связывается с HK как с участком тяжелой цепи, требующим ионы кальция, так и с легкой цепью, независимо от ионов кальция.54 Взаимодействие TSP с тяжелой цепью кининогенов может происходить в домене 3, перекрывающем последовательность KIC11.54

    Последней функцией, приписываемой домену 3, была активность кининогенов по ингибированию α-тромбина.48,50,55 Изолированный домен 3, полученный триптическим расщеплением LK в растворе, ингибировал индуцированную α-тромбином активацию тромбоцитов.50 Область ингибирования тромбина была не то же самое, что область связывания тромбоцитов, потому что одно моноклональное антитело (MoAb), которое не блокирует связывание клеток, нейтрализует способность HK ингибировать активацию тромбоцитов α-тромбином.50 Кроме того, область ингибирования α-тромбина на кининогенах не была одной из трех областей связывания клеток, KIC11, NAT26 или LDC27. 53,56,57 Две другие отдельные последовательности, одна из домена 3, а другая смежная с доменом 3 в домене 4, соответственно, способны ингибировать индуцированную тромбином активацию тромбоцитов с помощью различных механизмов. Kunapuli et al57 экспрессировали домен 3 в Escherichia coli , G235-M357. Рекомбинантный полипептид ингибировал индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов с IC 50 , равным 4 мкмоль / л.Следует отметить, что эта последовательность, в отличие от триптического гидролизата LK, не включает какую-либо часть домена 4. Белок, кодируемый экзоном 7, G235-Q292, показал IC 50 13,4 мкмоль / л и рекомбинантный пептид из 23 аминокислот, K270-Q292, показал IC 50 30 мкмоль / л. Наконец, синтетический гептапептид, расположенный в домене 3, L271-A277 (LNAENNA), был минимальной последовательностью для ингибирования агрегации тромбоцитов, индуцированной α-тромбином (IC 50 = 65 мкмоль / л). Как будет описано ниже, эта последовательность конкурирует за связывание тромбина с тромбоцитами, имитируя последовательность GPIb на тромбоцитах за связывание тромбина.

    В качестве альтернативы, Hasan et al56 указывают, что ингибирующая активность кининогенов тромбина, ранее приписываемая домену 3,50, полученному протеолитическим расщеплением, на самом деле является доменом 4 или остатком кинина, остающимся присоединенным к С-концу домена 3. В чистом виде или в плазме HK расщепляется калликреином плазмы на искусственной поверхности, брадикинин высвобождается из своего родительского белка тремя способами.58,59 Первое расщепление дает разорванный кининоген, состоящий из двух дисульфидно связанных цепей 64 и 56 кДа.Второе расщепление дает брадикинин (0,9 кДа) и промежуточный свободный от кинина белок с примерно такой же молекулярной массой, что и расщепленный HK. Третье расщепление приводит к стабильному, не содержащему кининов белку, состоящему из двух дисульфидно связанных цепей длиной 64 и 46 кДа. Однако, когда кининогены расщепляются в растворе без поверхности, эта последовательность не обязательно возникает, и брадикинин может оставаться прикрепленным к тяжелой или легкой цепи кининогенов.60 Поскольку изолированный домен 3 был получен протеолитическим расщеплением в растворе, мы исследовали оба расщепленных трипсином LK и домен 3 были получены триптическим расщеплением, и было обнаружено, что фрагмент брадикинина остается прикрепленным к тяжелой цепи LK и изолированному домену 3.32 Затем были проведены исследования, чтобы определить, блокируют ли брадикинин, аналоги брадикинина и продукты его распада, активацию тромбоцитов, индуцированную α-тромбином. В экспериментах, которые будут описаны ниже, было показано, что все эти фрагменты домена 4 являются ингибиторами агрегации тромбоцитов, вызванной α-тромбином, предотвращая отщепление α-тромбином своего клонированного рецептора (PAR1) 56.

    Конечно, домен 4, область брадикинина, имеет множество функций, приписываемых этому нанопептиду, в дополнение к его новейшей функции, ингибированию α-тромбина.56 При высвобождении брадикинина HK является лучшим субстратом для калликреина плазмы, а LK – лучшим субстратом для тканевого калликреина. Однако оба кининогена являются субстратами для обеих форм калликреина. Фактор XIIa расщепляет HK аналогично калликреину плазмы.61 Фактор XIa первоначально расщепляет HK на полосы 76 и 46 кДа. При длительном воздействии фактора XIa легкая цепь HK размером 46 кДа протеолизируется на более мелкие, неактивные фрагменты.62 Обработка LK эластазой делает белок лучшим субстратом калликреина плазмы для высвобождения брадикинина и Met-Lys-брадикинина, 63 разрушает прокоагулянтную активность HK.Катепсин D инактивирует ингибирующую активность цистеиновых протеаз кининогенов.64 Последняя функция домена 4 состоит в том, чтобы служить связывающей областью клетки.65 Карбоксиконцевая часть брадикинина и аминоконцевая часть общей легкой цепи кининогена участвуют в качестве низкоаффинных ( kd = 1 ммоль / л) сайт связывания с эндотелиальными клетками. Важность области связывания клетки с доменом 4 заключается не в ее изолированном сродстве к поверхности клетки, а в ее способности удерживать кининогены в надлежащей конформации для оптимального связывания клеток.26 Например, интактная HK связывается с эндотелиальными клетками, поддерживаемыми при 37 ° C с kd 7 нмоль / л и 1 × 10 7 молекул на клетку по сравнению с кининогеном, не содержащим кининов, который связывается с эндотелиальными клетками, поддерживаемыми при 4 ° C с kd 30 нмоль / л и от 1 до 2,6 × 10 6 молекул / клетка.31 Эти разные данные для взаимодействия интактных или бескининовых HK с биологическими поверхностями неудивительны, учитывая большое изменение формы HK, которое происходит, когда он вырезан на искусственной поверхности26

    Легкая цепь

    LK имеет размер 4 кДа и состоит из одного домена (D5 L ).Его функция неизвестна. Легкая цепь HK имеет размер 56 кДа и состоит из двух доменов: 5 (D5 H ) и 6. D5 H служит дополнительным сайтом связывания клеток на тромбоцитах, гранулоцитах и ​​эндотелиальных клетках35,49,51,66 Было обнаружено, что две области D5 H участвуют в связывании клеток.67 Одна находится на аминоконцевом конце домена и состоит из последовательностей G 402 KEQGHTRRHDWGHEKQRK 420 (GKE19) и H 421 NLGHGHKHERDQGHG1 (HNL21) (Рис 2).Эти пептиды ингибируют связывание биотин-HK с IC 50 , равным 792 и 215 мкмоль / л соответственно.67 Другая область находится на карбоксиконцевой области D5 H и входит в область двух перекрывающихся пептидов H 479 KHGHGHGKHKNKGKKNGKH 498 (HKh30) и H 471 VLDHGHKHKHGHGHGKHKNKGKK 494 (HVL24), которые ингибируют связывание HK с IC 50 и 0,8 мкм, соответственно, предварительные данные свидетельствуют о том, что область 0,26 мк2 / L , отвечающая за связывание с IC /9010 нейтрофилы на D5 локализованы на h520-h558, аналогично HNL21.68 Независимо от области связывания с клетками, D5 H был признан искусственным поверхностным участком связывания HK.28,69,70 D5 H богатые гистидином и глицином области обладают способностью связываться с анионными поверхностями, цинком и гепарин.69-72 Используя MoAb, который блокирует свертывание HK и связывание расщепленных HK с анионными поверхностями, 28 пептид массой 7,3 кДа был выделен на иммуноаффинной колонке, который был идентифицирован N-концевым анализом как h541-K497.72. Пептид из 57 аминокислот ингибировал коагулянтную активность и обладал способностью связываться с анионными поверхностями с IC 50 30 мкмоль / л.D5 H содержит два богатых гистидином и глицином участка, один на его карбоксиконцевой стороне, который также был богат лизином (h557-K502), аналогично HKh30, а другой – на его аминоконцевой стороне (K420-h558) , аналог HNL21. Используя стратегию делеционного мутагенеза на D5 H , было обнаружено, что область связывания анионной поверхности связана с обеими богатыми гистидин-глицином областями D5 H .70 Любая область была способна поддерживать коагулянтную активность при условии, что она была связана с D6. .70 Этот вопрос был дополнительно исследован с использованием синтетических пептидов.67 Было обнаружено, что пептиды HKh30 и HVL24, которые являются его высокоаффинными клеточными связывающими областями на карбоксиконцевой стороне D5 H , также ингибируют прокоагулянтную активность HK. 67 Никакие другие пептиды из D5 H , включая HNL21, не обладают этим свойством. Кроме того, поликлональные антитела, выращенные к HKh30, способны продлевать прокоагулянтную активность HK в плазме.67 Эти данные указывают на то, что области связывания эндотелиальных клеток и нейтрофильных клеток, а также область связывания искусственной поверхности на HK содержатся в одной и той же высококонсервативной области D5 H .Кроме того, области связывания эндотелиальных клеток и искусственной поверхности перекрываются.67 Пептид HKh30 и его родительский HK обладают дополнительной способностью взаимодействовать с белком M на Streptococcus pyogenes ,73 Интересно, что сайт связывания клеток с самым высоким сродством к D5 H оказывается сайтом связывания искусственной поверхности. Усилия многих исследователей за последние два десятилетия по характеристике связывания HK с искусственными поверхностями указали на расположение сайта связывания клеток HK.Наконец, когда HK не содержит брадикинина, остаточный кининоген, не содержащий кининов, обладает способностью предотвращать адгезионное взаимодействие витронектина с опухолевыми клетками, эндотелиальными клетками, тромбоцитами и моноцитами. 33 Это свойство намного слабее у интактных, непротеолизированных HK. Этот результат был предвосхищен открытием того факта, что после высвобождения брадикинина из HK полученный кининоген, не содержащий кининов, гораздо более прочно связывается с анионными поверхностями, чем нерасщепленный HK. Домен 6

    HK имеет прекалликреин (S565-K595) и сайт связывания фактора XI (P556-M613) (рис. 2).75-77 Сродство прекалликреина к его сайту связывания на легкой цепи HK составляет около 17 нмоль / л. 78,79 Сайт связывания прекалликреина и фактора XI состоит из последовательности из 31 остатка, которая содержит преимущественно β-поворотные элементы.80 Хотя было показано, что 30-аминокислотная область (S565-K595) является достаточной для связывания, более поздние исследования показывают, что укороченный на N-конце и C-конце 27-мер (W569-K595) имеет важные структурные элементы для связывания прекалликреина. Прокоагулянтная активность 81,82 HK зависит от двух активностей: (1) способности связываться с анионными поверхностями через D5 H и (2) способности связывать прекалликреин и фактор XI с доменом 6.28 Ингибирование любого взаимодействия с MoAb, направленного на эти области, будет ингибировать прокоагулянтную активность HK.28,83,84 Домен 6 HK служит акцепторным белком для связывания фактора XI и прекалликреина с тромбоцитами, нейтрофилами и эндотелиальными клетками37,85,86 Как будет показано ниже, связывание прекалликреина со связанными HK инициирует последовательность событий, которая приводит к активации прекалликреина на биологических поверхностях независимо от активации фактора XII.

    Прекалликреин (ПК) продуцируется одним геном, который отображается на хромосоме 4.Структура гена 87 PK аналогична структуре фактора XI. 88 Его мРНК кодирует тяжелую цепь из 371 аминокислоты и легкую цепь из 248 аминокислот, которые удерживаются вместе дисульфидной связью (рис. 3) .88 Аминокислотная последовательность PK имеет 58% гомологию с фактором XI.88 Белок имеет четыре тандемных повтора в аминоконцевой части молекулы из-за связывания первого и шестого, второго и пятого, а также третьего и четвертого полуцистеиновых остатков, присутствующих в каждом повторе ( Рис 3). Такое расположение приводит к четырем группам из 90 или 91 аминокислоты, которые расположены в так называемых яблочных доменах.89,90 Эти же структуры были описаны в факторе XI, что позволяет предположить общее событие генной дупликации предков для прекалликреина плазмы и фактора XI. 87,91

    Рис. 3.

    Структура прекалликреина. Буквы от A 1 до A 4 представляют яблочные домены тяжелой цепи прекалликреина. Обозначение Фактор XIIa и стрелка у аргинина 371 представляют сайт активации фактора XIIa на прекалликреине.Гистидин 415 , аспарагиновая кислота 464 и серин 559 представляют собой активный каталитический центр калликреина. Круг с заштрихованным фоном представляет области, участвующие в связывании высокомолекулярного кининогена. По материалам Chung et al. 89

    Рис. 3.

    Структура прекалликреина. Буквы от A 1 до A 4 представляют яблочные домены тяжелой цепи прекалликреина. Обозначение Фактор XIIa и стрелка у аргинина 371 представляют сайт активации фактора XIIa на прекалликреине.Гистидин 415 , аспарагиновая кислота 464 и серин 559 представляют собой активный каталитический центр калликреина. Круг с заштрихованным фоном представляет области, участвующие в связывании высокомолекулярного кининогена. По материалам Chung et al. 89

    В плазме PK проявляется в виде дублета 85 и 88 кДа, независимо от того, подвергся ли белок восстановлению.92,93 В плазме PK представляет собой быстрый γ-глобулин (изолэлектрическая точка = 8.5-9,0) с циркулирующей концентрацией в крови, оцененной от 35 до 50 мкг / мл (0,41-0,56 мкмоль / л) .94,95 Было показано, что печень человека является источником кДНК PK.89 При заболеваниях печени PK плазмы снижается.94 У женщин, принимающих оральные контрацептивы, уровень PK повышен, а у женщин во втором и третьем триместре беременности этого не происходит.14,94 Когда PK активируется в калликреин (α-калликреин) фактором XIIa или фактором XIIf, белок при электрофорезе в геле с восстановленным додецилсульфатом натрия (SDS) имеется две субъединицы: тяжелая цепь приблизительно 52 кДа и два варианта легкой цепи приблизительно 36 и 33 кДа.92,93 Активный центр калликреина содержится в его легкой цепи, поскольку эта область включает меченный тритием диизопропилфторфосфат в ковалентной связи с серином 559 .96 Гистидин 415 и аспарагиновая кислота 464 включают две другие аминокислоты, участвующие в каталитическая активность (рис. 3). Длительная инкубация калликреина с самим собой приводит к самоперевариванию его тяжелой цепи в полосы 33 и 20 кД, что видно на электрофорезе в восстановленном SDS-геле с образованием формы, называемой β-калликреином.97 Эти расщепления происходят через тандемные повторы в тяжелой цепи и приводят к белку, который расщепляет HK медленнее и не может активировать нейтрофилы или индуцировать их секрецию эластазы. 97,98 Электрофорез в невосстановленном SDS-геле искусственной, отрицательно заряженной поверхностной активации плазмы. приводит к появлению калликреина в комплексе с макроглобулином α 2 2 M) и ингибитором C1, а также к появлению фрагмента прекалликреина / калликреина массой 50 кДа, содержащего часть тяжелой цепи нативного белка.14 По крайней мере 75% PK циркулирует связанными, нековалентно, с HK.99 Области связывания на PK для HK находятся на доменах яблока 1 (F56-G86) и 4 (K266-G295) (рис. 3). 100-104 Прекалликреин области связывания для фактора XII локализованы в доменах яблока 3 и 4, но конкретная последовательность не определена. 100

    Превращение ПК плазмы человека in vitro в калликреин, его активную форму, катализируется активированным фактором XII на поверхности, усиленной HK, или фрагментом фактора Хагемана (βFXIIa) в жидкой фазе.96 В отсутствие фактора XII прекалликреин не активируется на искусственной поверхности. Именно из-за этого открытия эта система называется контактной системой. Одинарная связь (Arg 371 -Ile 372 ) расщепляется, образуя тяжелую цепь из 371 аминокислоты, все еще связанную с легкой цепью одним дисульфидным мостиком без изменения молекулярной массы. На поверхности эндотелиальных клеток это расщепление происходит в отсутствие фактора XII, когда PK связывается с HK.86 Легкая цепь калликреина реагирует с ингибиторами протеаз, в основном с α 2 M и ингибитором C1 (C1-INH).C1-INH образует стехиометрический комплекс 1: 1 с калликреином, 105-109, что приводит к потере протеолитической и амидолитической активности. HK защищает калликреин от ингибирования C1-INH и α 2 M в очищенной системе, 109,110, указывая на механизм субстратной (HK) защиты фермента (калликреина) от активных сайт-направленных ингибиторов протеазы. α 2 M ингибирует кинин-образующую активность, но только частично подавляет амидолитическую активность калликреина108, образуя ковалентный комплекс.Хотя на ингибитор C1 и α 2 M приходится равное количество ингибирования калликреина в плазме, ингибитор C1 в плазме действует быстрее, чем α 2 M.111 Антитромбин III также ингибирует калликреин, но это происходит медленно, даже в присутствие гепарина.112 В присутствии HK гепарин, который связывается с HK, 71,72 значительно ускоряет ингибирование калликреина антитромбином. Ингибитор протеина C также признан мощным ингибитором калликреина.113,114. Основными белковыми субстратами калликреина плазмы являются фактор XII, HK и проурокиназа.115 116

    Фактор XII продуцируется одним геном, который отображается на хромосоме 5.117,118. Ген фактора XII имеет длину 12 т.п.н. и состоит из 13 интронов и 14 экзонов.119 Как комплементарная ДНК (кДНК), так и последовательность ДНК, фактор XII имеет множественные домены с обширной гомологией последовательностей с областями тканевого активатора плазминогена (tPA; эпидермальный фактор роста [EGF] -подобная область и область крингла) и фибронектина (фиг. 4).119-121 Ген интрона / экзона фактора XII аналогичен по организации семейству сериновых протеаз генов tPA и генов активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), но отличается от большинства других генов белков свертывания крови.119 Его мРНК размером 2,4 т.п.н. одноцепочечный β-глобулин из 596 аминокислот с молекулярной массой от 80 до 90 кДа и изоэлектрической точкой от 6,1 до 6,5 (рис. 4) .122 Его концентрация в плазме оценивается в 30 мкг / мл (0,375 мкмоль / л). ; диапазон от 15 до 47 мкг / мл) .123,124 Было показано, что печень человека является источником ДНК фактора XII 120 , а культивируемые гепатоциты крысы синтезируют фактор XII.125 У людей эстрогены, вводимые женщинам в постменопаузе и беременным женщинам, повышают уровни фактора XII в плазме, и его экспрессия усиливается в изолированной печени крыс, получавших эстроген и пролактин. 126-128 Было показано, что ДНК печени крысы обладает функциональным регулятором эстрогена. Элемент, содержащийся в его 5′-нетранслируемой области, который модулируется 17β-эстрадиолом. 129 Фактор XII, содержащий домен EGF, усиливает пролиферацию клеток HepG2 и включение тимидина и лейцина, предполагая, что он является митогеном для этих клеток.130 Фактически, фактор XII через свой домен EGF функционирует как митоген и стимулирует путь передачи сигнала с помощью митоген-индуцированной протеинкиназы.131 Эта активность не зависит от протеолитической активности активированного фактора XII.

    Рис. 4.

    Структура фактора XII. Протеолиз по аргининам 334, 343 и 353 (см. Стрелки) приводит к активации фактора XII (β-фактора XIIa). Каталитическая триада фактора XIIa состоит из гистидина 393 , аспарагиновой кислоты 442 и серина 544 .Круг с заштрихованным фоном представляет собой искусственные поверхностные связывающие домены тяжелой цепи фактора XII. Круг с горизонтальными линиями представляет два цинк-связывающих домена фактора XII. По материалам Cool and MacGillivray.119

    Рис. 4.

    Структура фактора XII. Протеолиз по аргининам 334, 343 и 353 (см. Стрелки) приводит к активации фактора XII (β-фактора XIIa). Каталитическая триада фактора XIIa состоит из гистидина 393 , аспарагиновой кислоты 442 и серина 544 .Круг с заштрихованным фоном представляет собой искусственные поверхностные связывающие домены тяжелой цепи фактора XII. Круг с горизонтальными линиями представляет два цинк-связывающих домена фактора XII. По материалам Cool и MacGillivray.119

    Фактор XII можно разделить на две области: тяжелую цепь и легкую цепь. Тяжелая цепь содержит две искусственные поверхностные связывающие области, одну на дистальном аминоконцевом конце (I1-C28), а другую на ее участке фибронектина типа I (T134-R153) (рис. 4).132,133 Недавние исследования с использованием рекомбинантных мутантов с делецией фактора XII подтвердили эти результаты, а также показали, что третья область тяжелой цепи фактора XII, на втором EGF-подобном или крингл-домене (P313-R334, L344-R353), также участвовала в искусственной поверхности. связывание (рис. 4) .134 При контакте с отрицательно заряженными поверхностями FXII автоматически активируется (твердофазная активация) .135 Как связывание с поверхностью, так и расщепление во время аутоактивации приводят к отчетливым, определенным конформационным изменениям.136 Протеиназы плазмы, включая калликреин и плазмин плазмы, активируют фактор XII (FXII) в FXIIa (αFXIIa), разрывая связь, соединяющую Arg 353 -Val 354 , и генерируют двухцепочечную молекулу, состоящую из тяжелой цепи (353 остатка). ) и легкой цепи (243 остатка), удерживаемых вместе дисульфидной связью.120 Легкая цепь FXIIa представляет собой типичную сериновую протеиназу, содержащую канонические Asp 442 , His 393 и Ser 554 и является сайтом для ингибирования его основным плазменным ингибитором, C1-ингибитором.137 Фрагменты фактора Хагемана или фрагменты FXII (FXIIf, βFXIIa) (Mr = 30 кДа) продуцируются в результате дальнейшего протеолитического расщепления, в результате чего образуется цепь из 243 остатков, проявляющих каталитическую активность, присоединенную к фрагменту предыдущей тяжелой цепи с помощью одной дисульфидной связи. Дефекты легкой цепи фактора XII приводят к нарушению ферментативной активности белка. Фактор свертывания XII в Вашингтоне, округ Колумбия, имеет замену Cys 571 на Ser, что приводит к полной потере прокоагулянтной активности.138 Фактор XII свертывания крови Bern – это белок, который при расщеплении калликреина не может активировать фактор XI или прекалликреин. 139 Контактная активация возникает в результате активации фактора XII. Фактор XII может быть активирован при контакте с отрицательно заряженными поверхностями или добавлением протеазы, которая вызывает ферментативное расщепление. Эти два механизма были названы активацией в твердой и жидкой фазах соответственно.140

    Активация фактора XII, возникающая в результате связывания с отрицательно заряженными поверхностями 140–143, называется аутоактивацией.144-149 Некоторые данные свидетельствуют о том, что связывание Zn 2+ с фактором XII вызывает изменение конформации, которое делает белок более восприимчивым к развитию ферментативной активности при связывании с отрицательно заряженными поверхностями.150-152 Существует четыре сайта связывания цинка, два из которых которые были идентифицированы (h50-h54 и H78-H82) .153 Хотя существует большое количество потенциальных физиологических отрицательно заряженных поверхностей, которые in vitro могут быть связаны с аутоактивацией фактора XII, сама концепция аутоактивации никогда не была достаточно убедительным механизмом для объяснить активацию фактора XII и связанную с ним активацию контактной системы in vivo.Были изучены альтернативные механизмы активации фактора XII in vivo. Описан активатор фактора XII эндотелиальных клеток кролика, но у человека нет соответствующего примера.154 Наши собственные исследования показывают, что инкубация зимогенного фактора XII с эндотелиальными клетками пупочной вены человека не приводит к активации человеческого фактора XII (неопубликованные данные). . Однако сборка PK, связанного с HK, на эндотелиальных клетках пупочной вены человека приводит к активации PK независимо от фактора XII ассоциированной с клеткой тиолпротеазой.86 Более того, может происходить активация фактора XII этим путем. В отсутствие прекалликреина фактор XII не активируется на эндотелиальных клетках в очищенной системе или в плазме (неопубликованные данные).

    Ферментативная активация фактора XII приводит к образованию последовательно более мелких белков, каждый из которых имеет один и тот же сериновый сайт активного сайта. Активация зимогенного фактора XII калликреином, трипсином или плазмином плазмы приводит к уменьшению размера фермента, снижению его свойств связывания с поверхностью и снижению его коагулянтной активности.Существует две основные формы активированного фактора Хагемана: фактор XIIa (αXIIa), белок массой 80 кДа, состоящий из двух дисульфидно-связанных полипептидных цепей, и фактор XIIf (фрагменты фактора Хагемана, HFf, βXIIa), имеющий массу от 28 до 30 кДа. Фрагмент, полученный из фактора XIIa. 155-159 β-Фактор XIIa возникает в результате расщепления по аргининам 334, 343 и 353 120. Форма активированного фактора XII массой 80 кДа обладает способностью связываться с отрицательно заряженными поверхностями133, 134 и активировать фактор XI. Ферментативная форма фактора XII массой 28–30 кДа не имеет свойств связывания с поверхностью, но сохраняет способность активировать прекалликреин и C1.140,160,161

    Основным ингибитором протеаз плазмы активированного фактора XIIa и XIIf является ингибитор C1, на который приходится более 90% ингибирования этих протеаз в плазме. 162–165 Ингибитор C1 связывает оба белка и необратимо инактивирует их. Когда он связан с поверхностью каолина, фактор XIIa защищен от инактивации ингибитора C1166. Антитромбин III обладает некоторой ингибирующей активностью в отношении фактора XIIa.167 168 Ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) также ингибирует фактор XIIa.169 Эндотелиальные клетки могут также продуцировать белок, который нарушает активацию фактора XII, но не его коагулянтную или амидолитическую активность после образования 170

    Основным препятствием для понимания контактной системы является широко распространенное представление о том, что система не имеет биологического значения, потому что она полностью активируется на искусственных поверхностях.Хотя большинство исследований на сегодняшний день описывают активацию этой системы только на искусственных поверхностях, и было выполнено много работы по описанию физиологических, отрицательно заряженных поверхностей (например, кислых фосфолипидов, сульфата холестерина, сульфатидов, кристаллов подагры и т. Д.), Ни одно из них не было убедительным в качестве единый, объединяющий активатор этой системы in vivo. Физиологическая отрицательно заряженная поверхность для активации контактной системы на самом деле представляет собой сборку этих белков на биологических поверхностях, то есть на клеточных мембранах. В защищенной среде клеточных мембран мы теперь показали, что сборка контактных белков на мембранах эндотелиальных клеток приводит к мультибелковому комплексу, который приводит к активации прекалликреина независимо от активированного фактора XII.86 Этот механизм будет рассмотрен в следующем разделе. Подробные исследования белков контактной системы, взаимодействующих с клетками, привели к нынешней гипотезе о том, насколько эта система физиологически активна. Хотя есть некоторые индивидуальные различия между клетками, мы сначала обсудим общие особенности экспрессии контактных белков и взаимодействия с клетками внутрисосудистого компартмента.

    Основным белком для сборки контактной системы на клеточных мембранах является HK.Помимо того, что они содержатся в тромбоцитах, гранулоцитах и ​​эндотелиальных клетках, на каждой из этих клеток существуют незанятые сайты связывания для HK. 19-21,36-38, 45,171,172 Неизвестно, почему каждая из этих клеток содержит кининогены, а также имеет незанятые сайты связывания. В тромбоцитах менее 8% от общего количества HK тромбоцитов представляет собой HK, прочно связанное с мембраной тромбоцитов.19,45 При активации тромбоцитов секретируется 40% от общего количества HK тромбоцитов, а еще 40% от общего количества экспрессируется на активированной мембране тромбоцитов.45 Общий вклад тромбоцитов в HK плазмы составляет всего 0,23% .19,173 Локальная концентрация HK на активированной мембране тромбоцитов или около нее может в 10 раз превышать концентрацию этого белка в плазме, поскольку тромбоциты выводят свое гранулярное содержимое посредством экзоцитоза.19,45

    Большинство связанных с гранулоцитами HK, по-видимому, являются экзогенными HK, прочно связанными и не подлежащими обмену с поверхностью гранулоцитов. 174 Гранулоциты обладают способностью собирать все белки контактной системы.174 Эластаза, высвобождаемая из гранулоцитов, протеолизирует связанный с клетками HK.175 Первоначальные исследования показали, что эндотелиальные клетки пупочной вены человека способны интернализовать HK.20, 172 Однако более поздние подробные исследования показывают, что не существует механизма интернализации HK эндотелиальными клетками.31 в количестве HK, связанном с мембраной эндотелиальных клеток, когда клетки поддерживаются при 4 ° C по сравнению с 37 ° C, заключается в том, что при более высокой температуре наблюдается повышенная экспрессия сайтов связывания кининогена.20,31,35,172,176

    Имеются характерные особенности связывания кининогенов со всеми клетками. Во-первых, связывание кининогена с клетками имеет абсолютную потребность в Zn 2+ .20,21,36,38,171,172. Потребность в Zn 2+ , вероятно, не ограничивается опосредованием связывания HK с клетками его областью связывания цинка домена. 5.69,72 Связывание LK с тромбоцитами и эндотелиальными клетками также имеет абсолютную потребность в Zn 2+ .Эти данные показывают, что Zn 2+ необходим для экспрессии сайта связывания кининогена, предполагаемого рецептора.35,48 Хотя некоторые исследователи предположили, что кальций является кофактором связывания с эндотелиальными клетками и тромбоцитами, наши исследования показывают, что это действительно так. не влияет на связывание HK с нестимулированными тромбоцитами, эндотелиальными клетками или гранулоцитами.21,31,36 Однако кальций был необходимым условием для максимальной активации связывания LK или изолированной тяжелой цепи с эндотелиальными клетками после стимуляции сложными эфирами форбола.35 Когда HK или LK связываются с тромбоцитами, гранулоцитами или эндотелиальными клетками, аффинность связывания одинакова (Таблица 1). Поскольку аффинность связывания HK с клетками внутрисосудистого компартмента составляет от 7 до 52 нмоль / л, а концентрация HK в плазме составляет 670 нмоль / л, мы можем постулировать, что все сайты связывания кининогена во внутрисосудистом компартменте являются насыщенными in vivo. Количество сайтов связывания кининогенов на клетках внутрисосудистого компартмента зависит от типа клетки. Тромбоциты имеют приблизительно 1000 сайтов связывания на клетку; гранулоциты имеют приблизительно 50 000 сайтов на клетку; и эндотелиальные клетки имеют приблизительно 1 000 000 сайтов на клетку при охлаждении до 4 ° C и приблизительно 10 000 000 сайтов на клетку при поддержании при 37 ° C (Таблица 1).20,21,31,35,36,50

    Таблица 1. Экспрессия

    кининогена на клетках внутрисосудистого компартмента

    -LK при 4 ° C
    Тип клеток . кД (нмоль / л) * . Количество сайтов .
    Тромбоциты
    125 I-HK 15 ± 4 911 ± 239
    125 I-LK 147 216 27622
    125 I-D3 39 ± 8 1,227 ± 404
    Гранулоциты
    125 I-HK 10 ± 1.3 4,8 × 10 4
    Эндотелиальные клетки
    125 I-HK при 4 ° C 52 ± 13 9,3 × 10 5
    43 ± 8 9,7 × 10 5
    Биотин-HK при 4 ° C 46 ± 8 2,6 × 10 6
    Биотин-HK при 37 ° C 7 ± 3 1.0 × 10 7
    -LK при 4 ° C
    Тип ячейки . кД (нмоль / л) * . Количество сайтов .
    Тромбоциты
    125 I-HK 15 ± 4 911 ± 239
    125 I-LK 147 216 27622
    125 I-D3 39 ± 8 1,227 ± 404
    Гранулоциты
    125 I-HK 10 ± 1.3 4,8 × 10 4
    Эндотелиальные клетки
    125 I-HK при 4 ° C 52 ± 13 9,3 × 10 5
    43 ± 8 9,7 × 10 5
    Биотин-HK при 4 ° C 46 ± 8 2,6 × 10 6
    Биотин-HK при 37 ° C 7 ± 3 1.0 × 10 7

    Экспрессия кининогенов на клеточных мембранах – сложный процесс. Как указано выше в предыдущих разделах, по-видимому, существует несколько областей кининогенов, которые позволяют им взаимодействовать с различными клеточными рецепторами. Первой информацией об этом было открытие, что HK связывается с тромбоцитами, эндотелиальными клетками и гранулоцитами посредством участков на их тяжелой и легкой цепях.35,49,51,66 На самом деле HK имеет три домена, которые вписываются в предполагаемый рецептор (ы) кининогена на эндотелиальных клетках.65 Сайты взаимодействия между HK и его предполагаемым рецептором могут находиться в нескольких местах: 3 в домене 3, 1 в домене 4 , и 2 в домене 5.53,65,67. Очевидно, что последовательность пептида LDC27 из домена 3 и HKh30 из домена 5 являются областями связывания с наивысшим сродством на HK для эндотелиальных клеток.53,67 Важно понимать, что связывание даже низкоаффинная последовательность из домена 4, например, будет блокировать связывание целых HK с эндотелиальными клетками.65 Эта информация предполагает, что HK и, предположительно, LK очень плотно прилегают к своему сайту (-ам) связывания, предполагаемому рецептору (-ам). Фактически, поскольку K i и K d , рассчитанные на основе исследований связывания для HK, LK и всех их субъединиц, одинаковы, две цепи кининогенов не связываются с клетками оптимальным образом. .66,177 Этот вид некооперативного взаимодействия характеризуется потерей энтропии при связывании и предполагает, что весь HK изгибается, чтобы соответствовать своему сайту связывания, предполагаемому рецептору.177 В поддержку этого мнения, когда брадикинин высвобождается из HK, свободные от кининов HK связываются с эндотелиальными клетками с более низким сродством и меньшим количеством сайтов связывания.31,65 Аналогичным образом, когда LK расщепляется между доменами 1 и 2, так что существует При изменении конформации LK происходит снижение связывания LK с эндотелиальными клетками по сравнению с интактным LK.32 Эти изменения в биологии экспрессии HK на клеточных мембранах, когда брадикинин удаляется из белка, ретроспективно предсказуемы из основных конформационных изменения, которые имеют место между HK и кининогеном, не содержащим кининов, как показано в функциональных характеристиках74 в электронной микроскопии26 и документировано с помощью кругового дихроизма.178

    Сайт связывания кининогена, предполагаемый рецептор на эндотелиальных клетках, по-видимому, представляет собой структуру, которая может регулироваться. Во-первых, обработка эндотелиальных клеток метаболическими ингибиторами анаэробного и аэробного метаболизма и шунт гексозо-монофосфата отменяют способность HK связываться с клетками.31 Циклогексимид не влияет на связывание HK с эндотелиальными клетками. Во-вторых, температура или последовательность брадикинина в кининогенах влияет на уровень связывания кининогена с эндотелиальными клетками.31,65 В-третьих, обработка эндотелиальных клеток брадикинином приводит к увеличению связывания HK и LK, и этот путь опосредуется протеинкиназой C и рецептором брадикинина B1 эндотелиальных клеток. 35 В-четвертых, тяжелая цепь и LK имеют потребность в Са 2+ для форбол 12-миристат 13-ацетат 4-0-метиловый эфир активирует их сайт связывания с эндотелиальными клетками, тогда как HK не делает этого. 35 В-пятых, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента усиливают действие брадикинина на позитивную регуляцию сайта связывания HK на эндотелиальных клетках.35 Наконец, когда HK связывается с эндотелиальными клетками, он инициирует серию событий, которые позволяют ферменту, связанному с эндотелиальными клетками или матриксом, активировать прекалликреин, связанный с HK.86 Таким образом, брадикинин активирует связывание кининогена на эндотелиальных клетках, и кининогены могут влиять на брадикинин. формирование.35,86 Эти данные показывают, что эта система жестко контролируется аутокринным способом.

    Объединенные данные, описанные выше, указывают на то, что в крови и эндотелиальных клетках должен быть физико-химический рецептор (ы) для кининогенов.Недавние данные предполагают, что ряд белков-кандидатов может быть рецептором (ами) кининогена. Исследования ингибирования антител предполагают, что Mac-1 (CD11b / 18) может быть сайтом связывания HK на гранулоцитах.51 Было показано, что фибриноген является неконкурентным ингибитором связывания HK с гранулоцитами и стимулированными АДФ тромбоцитами.175 HK может связываться непосредственно с CD11b. / 18 на гранулоцитах или может взаимодействовать с рецептором, входящим в комплекс с этим интегрином (см. Ниже). Herwald et al180 изолировали на аффинной колонке HK от EA.hy926, линия эндотелиальных клеток пупочной вены человека, 179 – белок массой 33 кДа, который был идентифицирован как gC1qR. gC1qR – это известный белок рецептора C1181, который связывает только HK и пептиды из домена 5, но не LK или связывающие пептиды из домена 3. Кроме того, его способность связывать HK не требует Zn 2+ , хотя другие исследователи утверждают, что Zn 2+ требуется для блоттинга лигандов.182 Более того, только небольшая часть общего gC1qR эндотелиальных клеток обнаруживается на внешней мембране эндотелиальных клеток.183 Эти данные показывают, что gC1qR не может объяснить все характеристики рецептора кининогена. Фактор XII блокирует связывание HK с qC1qR.180 Эти данные подтверждают предыдущее открытие о том, что фактор XII частично блокирует связывание HK с эндотелиальными клетками.184 Только что описанный белок, связывающий кининоген, может составлять часть мультипротеинового рецепторного комплекса для объяснения особенностей связывания HK и LK. в клетки. Недавно были представлены предварительные доказательства того, что HKa также связывается с рецептором урокиназы на эндотелиальных клетках.185 Антитело к домену 2/3 рецептора урокиназы полностью ингибирует связывание HKa с эндотелиальными клетками, как и витронектин, лиганд этого рецепторного домена. Рецептор растворимой урокиназы заметно ингибирует связывание HKa и образует с ним цинк-зависимый комплекс в бесклеточной системе. Открытие того, что интегрины тесно связаны с рецептором урокиназы186 и могут усиливать связывание лигандов с доменом 2/3 рецептора урокиназы, может иметь отношение к взаимодействию кининогенов с нейтрофилами, которые отображают как интегрины, так и рецептор урокиназы.Недавние данные показывают, что HKa связывается непосредственно с клетками, трансфицированными Mac-1, и с очищенным Mac-1.186a. Взаимодействие рецептора урокиназы с CD11b / 18 может быть потенциальным путем, по которому связывание кининогена может передавать сигнал внутри клеток. Однако, поскольку тромбоциты не экспрессируют рецептор урокиназы, этот кандидатный сайт связывания также не может быть основным рецептором кининогена на всех клетках. Последние данные показывают, что цитокератин 1 является дополнительным сайтом связывания кининогена (HK и LK) на эндотелиальных клетках, тромбоцитах и ​​гранулоцитах.187 Связывание кининогена с цитокератином 1 требует Zn 2+ , и все клеточные связывающие домены кининогенов взаимодействуют с ним. gC1qR и suPAR блокируют связывание HK с цитокератином, предполагая, что эти белки участвуют в сборке нескольких белков на эндотелиальных клетках. Эти данные вместе с недавним открытием того, что цитокератин 8 является клеточным рецептором плазминогена, предполагают, что цитокератины могут представлять новый класс рецепторов презентации на клетках.188,189 Полная характеристика мультипротеинового рецепторного комплекса кининогена является следующей проблемой в этой области.

    На эндотелиальных клетках и тромбоцитах связывание кининогена модулирует активацию контактной системы. Связанный с тромбоцитами и эндотелиальными клетками HK защищен от активации экзогенным плазменным калликреином.66,190 Более того, HK служит сайтом связывания или рецептором для фактора XI и прекалликреина на тромбоцитах и ​​эндотелиальных клетках37,85,86,191 На сегодняшний день нет доказательств, указывающих на то, что Фактор XI, связанный с тромбоцитами, активируется до фактора XIa любым благоприятным образом.192 Однако прекалликреин, связанный с HK на тромбоцитах или эндотелиальных клетках, может приводить к его активации в калликреин с помощью фактора XIIa-зависимого85,193 или независимого86 механизма. Независимый от фактора XII механизм активации прекалликреина обусловлен ассоциированной с мембраной или матриксом тиолпротеазой, активность которой регулируется связыванием HK.86 Обе ситуации приводят к генерации брадикинина.86 Таким образом, сборка контактных белков клеточной мембраны посредством связывания может привести к в комплексе, который может быть активирован с помощью физиологических механизмов, что приводит к высвобождению брадикинина и кинин-зависимой активности.

    В дополнение к общим характеристикам контактных белков, взаимодействующих с клетками внутрисосудистого компартмента, как описано выше, существуют также некоторые уникальные межклеточные взаимодействия. Калликреин, но не PK, является хемотактическим для нейтрофилов.194 Воздействие на нейтрофилы концентраций калликреина, способных вызвать хемотаксис, увеличенный аэробный гликолиз и активность гексозо-монофосфатного шунта.194 В присутствии кальция нейтрофилы агрегируют в ответ на калликреин.195 Это взаимодействие связано со стимуляцией респираторного выброса нейтрофилов, на что указывает увеличение поглощения кислорода.195 Калликреин также побуждает нейтрофилы высвобождать эластазу нейтрофилов человека из их азурофильных гранулы 196 и нейтрофилы, необходимые для производства супероксида.197

    В плазме нейтрофилы человека выделяют эластазу во время свертывания крови, 198 но нейтрофилы, ресуспендированные в плазме с дефицитом PK или FXII, высвобождают менее одной трети количества эластазы, высвобождаемой в нормальной плазме человека.196 Метод кожного окна, который оценивает хемотаксис лейкоцитов in vivo в ответ на повреждение ткани или микрососудов, показывает значительное нарушение хемотаксиса у пациентов с дефицитом FXII и PK199. Этот результат предполагает, что калликреин и FXIIa важны для высвобождения эластазы. из нейтрофилов в плазме. Кроме того, калликреин индуцирует высвобождение эластазы из нейтрофилов in vitro в зависимости от концентрации, что требует присутствия как активного центра калликреина (на его легкой цепи), так и интактной тяжелой цепи.200 Необходимость нерасщепленной тяжелой цепи может быть объяснена необходимостью последовательностей как яблока 1, так и яблока 4 для связывания калликреина с HK на нейтрофилах.104,105 Образование калликреина, происходящее при человеческом сепсисе, экспериментальном артрите и энтероколите (см. Ниже), также будет задействовано. нейтрофилы для участия в защите организма. Было также показано, что FXIIa вызывает агрегацию нейтрофилов201 и дегрануляцию (высвобождение эластазы). FXIIf не будет стимулировать нейтрофилы, и, следовательно, требуется домен тяжелой цепи.Однако каталитическая активность FXIIa необходима, потому что ингибиторы активного центра, D-Pro-Phe-Arg-CH 2 Cl и ингибитор трипсина кукурузы, оба отменяют реакцию.

    Фактор XIIa может уменьшать количество рецепторов FcγR1 (Ig) на моноцитах, не влияя на его сродство. Это взаимодействие требует тяжелой цепи, но, в отличие от действия FXIIa на нейтрофилы, не требует каталитического аппарата легкой цепи.202 Сайт на FXII, ответственный за подавление FcγR1, может находиться в пределах N-концевых 18 аминокислот 203, и это уменьшение может нарушать клиренс иммунных комплексов. Toossi et al204 обнаружили, что фактор XII индуцирует синтез моноцитов и секрецию интерлейкина-1 (IL-1) и IL-6. Эти исследователи обнаружили, что секреция этих интерлейкинов, стимулированная липополисахаридами, также усиливается фактором XII.

    Первой и наиболее устойчивой функцией кининогенов плазмы является доставка брадикинина, мощного биологически активного пептида.1 Во многих отношениях кининогены и брадикинин, активирующий пептид из домена 4, способствуют проходимости сосудов, усилению кровотока и антитромботической / профибринолитической активности (Таблица 2). Сам по себе брадикинин является мощным стимулятором синтеза простациклина эндотелиальными клетками; ингибитор функции тромбоцитов, 205,206 образования супероксида, 207 и высвобождение тканевого активатора плазминогена; и стимулятор активации плазминогена, 208, 209 образования оксида азота, 210 и образования зависимого от эндотелиальных клеток фактора гиперполяризации гладких мышц.211 Кроме того, брадикинин, благодаря своей способности стимулировать образование NO и цГМФ в эндотелиальных клетках, обеспечивает основной стимул для предотвращения субэндотелиальной пролиферации гладких мышц212,213 В присутствии неповрежденного эндотелия кинины, по-видимому, предотвращают рост и пролиферацию гладких мышц сосудов214,215 В качестве альтернативы, когда сосуды повреждены, брадикинин стимулирует протеинкиназу C, а затем и MAP-киназы, что может привести к росту и пролиферации гладких мышц сосудов. 215-217 Таким образом, в неповрежденном сосуде сумма активностей брадикинина заключается в поддержании кровотока и проходимости сосудов. ; в отсутствие эндотелия брадикинин стимулирует восстановление сосудов, что может привести к пролиферации гладких мышц и гипертрофии интимы.

    Таблица 2. Антитромбиновая, антиадгезивная и профибринолитическая активность кининогенов

    Домен . Действия .
    Брадикинин Стимулирует образование простациклина
    Брадикинин Стимулирует образование NO
    Брадикинин Стимулирует образование супероксида 90Plus 821 90PBR, секреция секреции супероксида Предотвращает отщепление альфа-тромбином его рецептора (PAR1)
    Домен 1 Ингибирует предсердный природный фактор
    Домен 2 Предотвращает агрегацию тромбоцитов, связанных с кальпаином
    Домен 3 связывание тромбина с тромбоцитами и эндотелиальными клетками
    Домен 5 Предотвращает прилипание клеток к искусственным поверхностям
    Домен 5 Вытесняет фибриноген с поверхностей и клеток
    Домен 6 Рецептор прекалликреина и фактора XI на эндотелиальных клетках и нейтрофилах
    Домен . Действия .
    Брадикинин Стимулирует образование простациклина
    Брадикинин Стимулирует образование NO
    Брадикинин Стимулирует образование супероксида 90Plus 821 90PBR, секреция секреции супероксида Предотвращает отщепление альфа-тромбином его рецептора (PAR1)
    Домен 1 Ингибирует предсердный природный фактор
    Домен 2 Предотвращает агрегацию тромбоцитов, связанных с кальпаином
    Домен 3 связывание тромбина с тромбоцитами и эндотелиальными клетками
    Домен 5 Предотвращает прилипание клеток к искусственным поверхностям
    Домен 5 Вытесняет фибриноген с поверхностей и клеток
    Домен 6 Рецептор прекалликреина и фактора XI на эндотелиальных клетках и нейтрофилах

    Брадикинин влияет на свои изменения во внутрисосудистом компартменте, связываясь по крайней мере с двумя рецепторами, рецепторами B1 и B2.218,219 Оба этих рецептора связаны с G; таким образом, связывание брадикинина стимулирует передачу клеточного сигнала. Повышенный брадикинин приводит к усилению клеточной стимуляции. Блокирование рецептора B2 антагонистом Hoe 140 (D-Arg, [Hyp 3 , Thi 5 , D-Tic 7 , Oic 8 ] -брадикинин) у развивающихся крыс приводит к более высокому кровяному давлению, частота сердечных сокращений и вес тела выше контрольных.220 Считается, что модуляция in vivo уровней брадикинина ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) является основой кардиозащитных свойств этих агентов.221 222 Ингибиторы АПФ индуцировали образование NO и простациклина в культивируемых эндотелиальных клетках крупного рогатого скота и защищали изолированное перфузируемое сердце от ишемии. 223 Действие ингибиторов АПФ на повышение уровня NO и защиту изолированного ишемизированного сердца было отменено антагонистом рецептора В2, лечением ингибитором АПФ Hoe 140.224 спонтанно Крысы с гипертонической болезнью предотвращали развитие гипертонии и гипертрофии левого желудочка, а Hoe 140 блокирует эти эффекты.225, 226 Эти данные на животных были распространены на людей, у которых ингибиторы АПФ также, как было показано, защищают от инфаркта миокарда, увеличивая кровоток миокарда и уменьшая ишемические изменения.Хотя эти кардиозащитные эффекты ингибиторов АПФ могут быть достаточно объяснены одним только действием брадикинина на сосудистую сеть, недавняя информация о том, что этот пептид и продукты его распада также являются селективными ингибиторами α-тромбина, также могут внести свой вклад (см. Ниже) 56

    .

    В дополнение к благотворному действию кининов по поддержанию проходимости сосудов было показано, что белки-предшественники брадикинина, кининогены, избирательно ингибируют индуцированную α-тромбином активацию тромбоцитов.Существует по крайней мере три механизма, с помощью которых кининогены влияют на индуцированную α-тромбином активацию тромбоцитов и эндотелиальных клеток 48,50,235 (Таблица 2). Первый механизм является косвенным, вероятно, опосредованным способностью кининогена ингибировать тромбоцитарный кальпаин. Когда α-тромбин активирует тромбоциты, кальпаин тромбоцитов, связанный с цитозольной или внутренней мембраной, перемещается на активированную поверхность тромбоцитов. 46,47 Внешний кальпаин тромбоцитов способен протеолизовать гликопротеины поверхностных мембран тромбоцитов, такие как гликопротеин Ib.236 Кальпаин тромбоцитов также протеолизирует предполагаемый рецептор АДФ тромбоцитов, который обнажает рецептор фибриногена тромбоцитов и, таким образом, способствует агрегации тромбоцитов. 235,237 Таким образом, ингибирование экстернализованного кальпаина тромбоцитов лейпептином или HK, т.е. ингибиторами кальпаинов, приводит к ингибированию α-тромбин – опосредованная агрегация тромбоцитов путем предотвращения связывания фибриногена.55,235 Эти данные были использованы для разработки группы соединений, смоделированных на основе домена 2 кининогенов, которые предотвращают агрегацию тромбоцитов, индуцированную α- и γ-тромбином, не мешая другим агонистам тромбоцитов и внутриклеточным тромбоцитам, индуцированным активация.238 Селективные ингибиторы агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином, могут быть разработаны путем создания пептидов, смоделированных на основе домена 2 кининогенов.

    Дополнительные исследования показали, что существует больше механизмов, с помощью которых кининогены ингибируют индуцированную α-тромбином активацию тромбоцитов. Было обнаружено, что HK и LK ингибируют агрегацию и секрецию тромбоцитов, индуцированную α-тромбином. 48,56 Поскольку секреция тромбоцитов, индуцированная α-тромбином, не зависит от агрегации тромбоцитов и происходит до нее, кининогены должны препятствовать индуцированной α-тромбином активации тромбоцитов другими факторами. механизмы, чем просто ингибирование агрегации тромбоцитов, связанной с кальпаином.Было обнаружено, что 239 HK, LK и D3 неконкурентно ингибируют связывание тромбина, обработанного Phe-Pro-Arg-хлорметилкетоном, с сайтом с высоким сродством тромбоцитов и эндотелиальными клетками 31,48,50,56,240. Открытие было одним из объяснений того, как вся активация тромбоцитов α-тромбином может блокироваться белками с большой молекулярной массой, такими как HK и LK. Дополнительные исследования выявили другие механизмы торможения.

    Kunapuli et al57 обнаружили, что рекомбинантный домен 3 (не содержащий остатков домена 4) ингибировал индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов только с вдвое меньшей аффинностью, чем очищенный HK, что указывает на то, что по крайней мере один сайт для ингибирования находится в домене 3 (рис. .Минимальная последовательность ингибирования α-тромбина представляла собой Leu 271 -Ala 277 . 57 Leu 271 -Ala 277 не ингибировал агрегацию тромбоцитов под действием АДФ или коллагена. Он не подавлял амидолитическую или свертывающую активность тромбина. Leu 271 -Ala 277 также не ингибировал изменение формы тромбоцитов и не подавлял агрегацию тромбоцитов SFLLRN. Bradford et al241 получили доказательства того, что Leu 271 -Ala 277 и K270-Q292 ингибируют индуцированную тромбином активацию тромбоцитов при низких концентрациях тромбина, ингибируя связывание тромбина с комплексом GPIb-IX-V.Кроме того, антитела к GPIbα и лиганды ингибировали связывание HK с тромбоцитами, а HK ингибировали связывание антител к GPIbα с тромбоцитами. Более того, пептиды домена 3 напрямую ингибируют высокоаффинное связывание I-α-тромбина с тромбоцитами. Наконец, HK ингибировал связывание тромбина с фибробластами, трансфицированными GPIb-IX-V. Эти данные свидетельствуют о том, что пептиды домена 3 могут блокировать связывание α-тромбина с его высокоаффинным сайтом на GPIbα. Последовательность NAEN появляется в HK, пептидах домена 3 и лиганд-связывающем домене GPIbα.Возможно, что домен 3 HK может имитировать этот высокоаффинный сайт связывания тромбина. Эти данные не обязательно означают, что связывание тромбина с GPIbα само по себе приводит к активации тромбоцитов. Скорее, GPIbα может служить для презентации тромбина клонированному рецептору тромбина, связанному с G-белком, тем самым снижая концентрацию тромбина, необходимую для расщепления последнего рецептора. Кининогены, блокируя это взаимодействие, будут затем модулировать активацию тромбоцитов, индуцированную тромбином.

    Рис.5.

    Домены, ингибирующие тромбин кининогенов. Кружок на сплошном фоне обозначает ингибирующую активность тромбина. Круг с заштрихованным фоном представляет область связывания клеточной мембраны. Круг с диагональными линиями представляет перекрывающуюся активность ингибирования папаина и активность связывания с клеточной мембраной.

    Рис. 5.

    Домены ингибирования тромбина кининогенов. Кружок на сплошном фоне обозначает ингибирующую активность тромбина. Круг с заштрихованным фоном представляет область связывания клеточной мембраны.Круг с диагональными линиями представляет перекрывающуюся активность ингибирования папаина и активность связывания с клеточной мембраной.

    Третий механизм ингибирования α-тромбина был описан Hasan et al.56 Кининогены и производные от него пептиды фактически ингибируют индуцированную α-тромбином активацию тромбоцитов, блокируя способность фермента расщеплять клонированный рецептор тромбина (PAR1) .56 В уже описанной выше работе очищенный домен 3, полученный в результате протеолитического расщепления, действительно имел присоединенный к нему домен 4.32,56 Было обнаружено, что пептиды из домена 4, BK и родственных последовательностей ингибируют активацию тромбоцитов, индуцированную α-тромбином (рис. 5). Хотя HK, LK и D3 с большой молекулярной массой ингибировали связывание α-тромбина с тромбоцитами, изолированный домен 4, то есть брадикинин (RPPGFSPFR) и MKRPPGFSPFRSSRIG, не ингибировал связывание.48,50,56 Эти данные показали, что действует другой механизм. эти пептиды блокируют активацию тромбоцитов, индуцированную α-тромбином. Подобно родительским белкам HK и LK, пептиды домена 4 не ингибировали способность α-тромбина расщеплять трипептидный субстрат или фибриноген сгустка, что позволяет предположить, что эти пептиды не взаимодействуют с активным сайтом α-тромбина или экзосайтом связывания аниона.31,48,50,56 Более того, как HK и LK, эти пептиды не были субстратами α-тромбина и не образовывали комплексов с α-тромбином.31,48,56 Пептиды домена 4 не блокировали АДФ-, коллаген- , или U46619-индуцированная агрегация тромбоцитов in vitro.56 Они действительно блокировали индуцированную α-тромбином мобилизацию кальция и индуцированную γ-тромбином агрегацию тромбоцитов в плазме in vitro.56 Минимальная форма домена 4, которая ингибирует индуцированную α-тромбином активацию тромбоцитов был пептид RPPGF (рис. 5) .56 RPPGF является основным продуктом распада ангиотензинпревращающего фермента брадикинина в плазме со скоростью метаболической деградации 4.2 часа. 242 243 Механизм, с помощью которого RPPGF и родственные пептиды домена 4 ингибируют активацию тромбоцитов, индуцированную α-тромбином, уникален. RPPGF не блокирует пептид рецептора тромбина, SFLLRN, от индукции активации тромбоцитов. 56 Пептиды домена 4 препятствуют α-тромбину от расщепления клонированного рецептора тромбина, чтобы инициировать процесс активации. Этот результат означает, что пептиды домена 4 фактически препятствовали α-тромбину от расщепления клонированного рецептора тромбина после аргинина 41 , что является критическим шагом в активации α-тромбина клеток через этот рецептор.56 Когда был получен пептид, охватывающий сайт расщепления α-тромбином на клонированном рецепторе тромбина (NATLDPRSFLLR), RPPGF и HK фактически препятствовали α-тромбину расщеплять этот пептид между аргинином и серином. 56 RPPGF специфически влиял на способность тромбина к расщепляют клонированный рецептор тромбина для активации тромбоцитов, не влияя на его прокоагулянтную активность. Эти объединенные данные показывают, что пептиды домена 4 и та же последовательность в кининогенах являются селективными протеолитическими ингибиторами активации тромбоцитов, индуцированной α-тромбином, будучи направленными на субстрат α-тромбина, клонированный рецептор тромбина.Соединения на основе последовательности RPPGF могут представлять новый класс ингибиторов тромбина, которые достигают селективности, будучи направленными на субстраты тромбина, а не на сам фермент.

    Помимо этих уникальных механизмов ингибирования α-тромбина, контактные белки участвуют в клеточном фибринолизе. Со времени распознавания дефицита HK этому белку приписывают роль в фибринолитическом процессе, хотя конкретный физиологический механизм не был известен.2,4 Уже более 35 лет известно, что контактная активация может увеличивать общий фибринолиз плазмы. 244 Калликреин, фактор XIIa и фактор XIa расщепляют плазминоген напрямую, хотя и гораздо менее эффективно, чем tPA или uPA. 245-248 Однако брадикинин имеет был охарактеризован как мощный и селективный in vivo индуктор высвобождения активатора плазминогена тканевого типа из эндотелиальных клеток кроликов и людей.208,209 Плазменный калликреин также был охарактеризован как кинетически благоприятный активатор одноцепочечной урокиназы in vitro.116 Более поздние исследования показали, что активация одноцепочечной урокиназы калликреином может лучше всего происходить на поверхности тромбоцитов и эндотелиальных клеток.85,193,249

    Эти исследования побудили нас изучить взаимосвязь сборки прекалликреина на эндотелиальных клетках и то, как он может участвовать в активации одноцепочечной урокиназы (таблица 2) .86 Когда прекалликреин связывается с HK на эндотелиальных клетках, зимоген активируется до калликреина, как указано. за счет развития амидолитической активности, изменения структуры прекалликреина на калликреин при гель-электрофорезе и расщепления HK.86 Активация прекалликреина происходит независимо от любых активированных форм фактора XII. Активирующий прекалликреин фермент (ы) не является сериновой протеазой, а ассоциированной с мембраной или матрикс-ассоциированной тиолпротеазой.86 Активация прекалликреина эндотелиальными клетками кинетически подобна активации прекалликреина фактором XII на искусственной поверхности. Эти данные впервые показывают, что контактная сборка белка на эндотелиальных клетках приводит к активации прекалликреина в отсутствие фактора XII и искусственной поверхности.86 Эта сборка контактных белков позволяет активировать физиологический путь этой системы. Степень активации прекалликреина регулируется HK. Повышение концентрации HK активирует фермент, который активирует связанный с клетками прекалликреин. Таким образом, HK регулирует активацию прекалликреина, которая, в свою очередь, высвобождает больше брадикинина из связанных с клетками HK и удаляет HK с поверхности, чтобы замедлить активацию прекалликреина.86 В подтверждение этого механизма мы недавно показали, что пептиды, полученные из D6 HK, могут подавляют образование плазмина, препятствуя связыванию прекалликреина с HK на поверхности эндотелиальных клеток.250 Кроме того, повышенный уровень брадикинина увеличивает связывание кининогена, что снижает расщепление растворимого калликреина на HK для высвобождения большего количества брадикинина. 35 Таким образом, существует строго регулируемый путь активации прекалликреина и высвобождения брадикинина.

    Путь активации прекалликреина на эндотелиальных клетках участвует в двух путях фибринолиза. Во-первых, калликреин расщепляет HK с высвобождением брадикинина, который является наиболее мощным и специфическим стимулятором высвобождения активатора плазминогена тканевого типа эндотелиальных клеток.208,209 Во-вторых, калликреин индуцирует кинетически благоприятное превращение одноцепочечной урокиназы в двухцепочечную урокиназу в среде, в которой существует конститутивная молярная избыточная секреция ингибитора активатора плазминогена эндотелиальных клеток-1,86,250. Образование двухцепочечной урокиназы приводит к 4,3- кратное увеличение активации плазминогена. Эта система активации плазминогена происходит в среде, в которой отсутствует фактор XIIa. Этот механизм активации одноцепочечной урокиназы представляет собой путь клеточного фибринолиза, который либо не зависит от активации одноцепочечной урокиназы, либо связан с ней, связанной с ее связыванием с рецептором.251 Возможное связывание HK (и, следовательно, калликреина) с доменом 2/3 рецептора урокиназы 185 на той же молекуле, что и проурокиназа, которая связывается с доменом 1 рецептора, может способствовать очень эффективному расщеплению последнего калликреином. . Кроме того, HK может конкурировать с витронектином, который также связывается с доменом 2/3 рецептора урокиназы, и замещать витронектин и связанную с ним молекулу, ингибитор-1 активатора плазминогена, тем самым усиливая фибринолиз.

    Было высказано предположение, что активация контактной системы является одним из медиаторов синдрома системного воспалительного ответа (SIRS).267 Контактная активация фактора XII и прекалликреина при сепсисе приводит к расщеплениям, которые активируют их ферменты, которые быстро реагируют с C1-ингибитором с образованием комплексов фактора XIIa-C1-INH и калликреин-C1-INH (Таблица 3) .268 Результатом является истощение функционального прекалликреина и фактора XII с сохранением нормальных уровней соответствующих антигенов. Функциональный C1-ингибитор также снижается, но его антиген остается постоянным или может даже увеличиваться, что позволяет предположить, что он ведет себя как слабый реагент острой фазы.По мере снижения функционального C1-INH, α 2 M становится более важным ингибитором калликреина и формируются комплексы α 2 M-Kal.14 Коагулянтная активность HK и антиген снижаются параллельно.269 Парадоксально, но по неизвестным причинам функциональный фактор XI может увеличиться 269

    Обследования пациентов с грамотрицательным сепсисом показали, что функциональный фактор XII, прекалликреин и C1-INH снижены у пациентов с гипотензивной септицемией.270 У пациентов с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (ДВС) из-за сепсиса или виремии снижен функциональный фактор XII, прекалликреин и C1-INH, но у лиц с ДВС-синдромом, вторичным по отношению к неоплазии, не было значительных изменений в системе калликреин-кинин.270 сепсис, снижение активности прекалликреина и повышение брадикинина были связаны с положительными посевами крови и гипотонией.271 При экспериментальном заражении людей брюшным тифом у всех пациентов с брюшным тифом было выявлено снижение функционального прекалликреина и C1-INH, но соответствующие антигены остались неизменными. .272 При респираторном дистресс-синдроме взрослых (ARDS) у затронутых пациентов были снижены уровни фактора XII и прекалликреина в плазме. 269 273 HK и активность C1-INH также снизились, но были повышены уровни антигена C1-INH. Снижение уровней прекалликреина также было зарегистрировано у пациентов с сепсисом, вызванным вирусами, грибками или риккетсиями. У пациентов с пятнистой лихорадкой Скалистых гор снизились уровни прекалликреина, но увеличились комплексы калликреин-C1-ингибитор.274 Поскольку комплексы калликреин-C1-ингибитор быстро выводятся в большинстве случаев септического шока, 275 мы разработали сэндвич-ферментный иммуноферментный анализ для α 2 комплексов M-Kal и обнаружили, что при септической гипотензии, но не только при сепсисе, уровни α 2 комплексов M-Kal были повышены.276

    Ни одно из упомянутых выше исследований не показало, является ли активация контактной системы ранним событием или связано с такими осложнениями сепсиса, как гипотензия и полиорганная недостаточность. Чтобы ответить на этот вопрос, нормальные добровольцы получили низкую дозу эндотоксина E coli (0,4 нг / кг массы тела). У этих людей развилось гриппоподобное заболевание, связанное с гипердинамическим сердечно-сосудистым состоянием, которое длилось 24 часа.277 Функциональные уровни прекалликреина были значительно ниже в группе эндотоксина по сравнению с контролем через 2 часа после инфузии и оставались низкими на протяжении остальной части экспериментального протокола через 5 и 24 часа. Концентрация комплексов α 2 M-Kal была значительно увеличена в четыре раза в группе, получавшей эндотоксин, на 3 часа и в пять раз на 5 часов, со снижением до нормальных уровней комплексов в кровотоке на 24 часа. Таким образом, низкая доза эндотоксина может вызвать длительное состояние контактной активации.

    Чтобы доказать, что контактная активация связана либо с шоком, либо с ДВС-синдромом, были проведены исследования на животных (Таблица 4). В установленной экспериментальной модели бактериемии у бабуинов две концентрации E coli были использованы для получения летальной и нелетальной гипотензии. В летальной группе развилась необратимая гипотензия, которая значительно коррелировала как со снижением функциональных уровней HK, так и с увеличением комплексов α 2 M-Kal.278 В нелетальной группе наблюдалась обратимая гипотензия, менее заметное снижение HK и лишь небольшое повышение α 2 M-Kal. 278 Необратимая гипотензия коррелировала с активацией контактной системы. Дальнейшие исследования были проведены для выяснения причин контактной активации при шоке и гипотонии. MoAb к человеческому фактору XII, который способен in vitro ингибировать коагулянтную активность фактора XII в плазме павиана на 60% и медленное расщепление кининогена в плазме павиана, активированной декстрансульфатом, вводили смертельной группе павианов за 30 минут до E coli .279 Хотя снижение уровня фактора V, фибриногена и тромбоцитов было одинаковым в обеих группах, а значения прекалликреина были нормальными, в группе без лечения наблюдалось заметное снижение HK, достигающее 40% от исходного уровня к 300 минутам. В группе, получавшей MoAb к фактору XII, HK оставался стабильным и был значительно выше (110% от исходного уровня) через 360 минут. Кроме того, в необработанной группе наблюдалось прогрессивное увеличение комплексов α 2 M-Kal, которое было очень значительным и полностью блокировалось MoAb в обработанной группе.Значительное снижение среднего системного артериального давления наблюдалось в обеих группах животных между 60 и 120 минутами. График Каплана-Мейера показал, что обработанные животные выживали значительно дольше, чем необработанные животные. Подавление активации контактной системы с MoAb к фактору XII модулировало гипотензию.279

    Таблица 4.

    Экспериментальные заболевания Состояния, для которых активация контактной системы является патогенетической

    6 906 D –
    Болезнь 4-150 . ПК . HK . C1 INH . XI (Закон) . XII (Акт.) . Комплексы α2M-Kal (Ант.) . Комплексы C1 INH-Kal (Ант.) .
    . Закон. . Ант. . Закон. . Ант. . Закон. . Ант. . . . . .
    Сепсис павиана 278,279 D D I I I D D
    Энтероколит крысы 286,2876 –6 –6 –6 –6 – D
    6 906 D –
    Болезнь 4-150 . ПК . HK . C1 INH . XI (Закон) . XII (Акт.) . Комплексы α2M-Kal (Ант.) . Комплексы C1 INH-Kal (Ант.) .
    . Закон. . Ант. . Закон. . Ант. . Закон. . Ант. . . . . .
    Сепсис павиана 278,279 D D I I I D D
    Энтероколит крысы 286,2876 –6 –6 –6 –6 – Д

    сравнительных исследований противовоспалительной, антикоагулянтной, антиангиогенной и антиадгезивной активности девяти различных фукоиданов из бурых морских водорослей | Гликобиология

    Аннотация

    Противовоспалительные, антиангиогенные, антикоагулянтные и антиадгезивные свойства фукоиданов, полученных из девяти видов бурых водорослей, были изучены с целью изучения влияния происхождения и состава фукоидана на их биологическую активность.Все фукоиданы ингибировали рекрутирование лейкоцитов в модели воспаления у крыс, и ни содержание фукозы и сульфата, ни другие структурные особенности их полисахаридных скелетов существенно не влияли на эффективность фукоиданов в этой модели. Оценка in vitro опосредованной P-селектином адгезии нейтрофилов к тромбоцитам в условиях потока показала, что только полисахариды из Laminaria saccharina , L. digitata , Fucus evanescens , F. serratus , F.distichus , F. spiralis и Ascophyllum nodosum могут служить ингибиторами Р-селектина. Все фукоиданы, за исключением фукоиданов из Cladosiphon okamuranus , несущих значительные уровни 2- O -α-d-глюкуронопиранозил разветвлений в линейной (1 → 3) -связанной поли-α-фукопиранозидной цепи, проявляли антикоагулянтную активность, измеренную с помощью активированного частичное тромбопластиновое время, тогда как только фукоиданы из L. saccharina , L. digitata , F.serratus , F. distichus и F. evanescens показали сильную антитромбиновую активность в тесте на агрегацию тромбоцитов. Последние фукоиданы сильно ингибировали тубулогенез эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) in vitro, и это свойство коррелировало со сниженными уровнями ингибитора активатора плазминогена-1 в супернатантах HUVEC, предполагая возможный механизм индуцированного фукоиданом ингибирования тубулогенеза. Наконец, фукоиданы из L. saccharina , L.digitata , F. serratus , F. distichus и F. vesiculosus сильно блокировал адгезию клеток карциномы молочной железы MDA-MB-231 к тромбоцитам, что могло иметь решающее значение для метастазирования опухоли. Представленные здесь данные дают новое обоснование для разработки потенциальных лекарств от тромбоза, воспаления и прогрессирования опухоли.

    Введение

    Фукоиданы представляют собой класс обогащенных фукозой сульфатированных полисахаридов, обнаруженных во внеклеточном матриксе бурых водорослей.Подобные сульфаты фукана были выделены также из морских беспозвоночных (студенистая оболочка яиц морских ежей и стенки тела морских огурцов) (Berteau and Mulloy 2003). Некоторые биологические свойства фукоиданов были исследованы на различных экспериментальных моделях. Фукоиданы, как и гепарин, могут ингибировать активность тромбина путем прямого воздействия на фермент (Grauffel et al. 1989) или путем активации ингибиторов тромбина, включая антитромбин III и кофактор гепарина II. Некоторые фукоиданы активируют только антитромбин, тогда как другие взаимодействуют с обоими ингибиторами (Mauray et al.1995; Pereira et al. 1999; Кузнецова и др. 2003 г.). На основании этих наблюдений и других предыдущих выводов (Нарделла и др. 1996; Помин и др. 2005) было высказано предположение, что фукоиданы могут представлять собой многообещающих кандидатов в качестве антикоагулянтов. Кроме того, было показано, что фукоиданы обладают антипролиферативной и антиадгезивной активностью (McCaffrey et al. 1992), а также могут защищать клетки от заражения вирусами (Boisson-Vidal et al. 1995; Damonte et al. 2004).

    Растущее количество экспериментальных данных указывает на то, что фукоиданы могут действовать как противовоспалительные агенты в нескольких экспериментальных моделях на мышах.В этом отношении перфузия фукоиданов в миокард может подавлять инфильтрацию нейтрофилов и повреждение после ишемии-реперфузии этого органа (Kubes et al. 1995; Omata et al. 1997). Кроме того, фукоиданы могут уменьшить экстравазацию лейкоцитов в спинномозговую жидкость во время менингита (Granert et al. 1999). Постулируются возможные механизмы, с помощью которых фукоиданы могут влиять на рекрутинг лейкоцитов. Способность этих агентов предотвращать опосредованные селектином межклеточные взаимодействия подтверждается экспериментами in vitro, показывающими, что фукоиданы действительно могут связываться с очищенными и подвергнутыми воздействию мембран P- и L-селектинами (Foxall et al.1992), но не E-селектин (Game et al. 1998).

    Предполагается также роль фукоиданов как противоопухолевых агентов. В различных исследованиях сообщалось о противоопухолевой и антиметастатической активности фукоиданов на моделях ксенотрансплантатов на мышах (Yamamoto et al. 1984; Coombe et al. 1987; Riou et al. 1996). Более того, было показано, что фукоиданы вызывают апоптоз в линиях раковых клеток и способствуют индуцированной макрофагами гибели опухолевых клеток. Кроме того, было показано, что эти соединения блокируют взаимодействия между раковыми клетками и базальной мембраной.Наконец, было обнаружено, что некоторые фукоиданы, особенно те, которые экстрагированы из Fucus vesiculosus , ингибируют ангиогенез, препятствуя связыванию фактора роста эндотелия сосудов (Koyanagi et al., 2003) и основного фактора роста фибробластов (bFGF) (Soeda et al. 2000) к своим рецепторам.

    Из-за трудностей определения химической структуры фукоиданов водорослей связь между их структурой и биологической активностью остается в значительной степени неизвестной. По этой причине эти соединения стали коммерчески доступны в основном в виде неохарактеризованных структурно сырых препаратов, например фукоидана из F.vesiculosus . Этот препарат может содержать примеси других типов полисахаридов и неуглеводных сопутствующих веществ. Поэтому некоторые важные корреляции между структурой и биологической активностью были выявлены при исследовании антикоагулянтной активности фукансульфатов, выделенных из беспозвоночных, которые доступны в очень ограниченных количествах, но обладают, в отличие от фукоиданов бурых водорослей, регулярной структурой. Цепи фукана животного происхождения состоят из повторяющихся олигосахаридных единиц, различающихся количеством и расположением сульфатных групп (Pereira et al.1999). Было показано, что их антикоагулянтная активность зависит не только от их молекулярной массы и степени сульфатирования, но также от распределения сульфатных групп в повторяющихся звеньях и от структуры основной цепи полимера (Pereira et al. 1999).

    Из-за большого разнообразия биологических эффектов, вызываемых фукоиданами, в настоящее время стоит задача исследовать, могут ли быть какие-либо различия или сходства в структурных особенностях фукоиданов, которые могут объяснять определенные биологические эффекты этих соединений, включая их способность регулировать селектин-опосредованное воспаление, свертывание крови, ангиогенез и клеточная адгезия.Наши результаты показывают несколько примечательных различий в активности фукоиданов из разных видов водорослей, которые, вероятно, связаны с различиями в химической структуре этих соединений. Эта работа была направлена ​​на отбор наиболее активных образцов фукоидана для дальнейшего изучения в качестве потенциальных новых препаратов для лечения тромбоза, воспаления и рака.

    Результаты

    Структурные мотивы фукоиданов бурых водорослей

    Химический состав исследуемых фукоиданов представлен в таблице I.В отличие от обычных фукановых сульфатов животных, фукоиданы морских водорослей являются гетерогенными и представляют собой смеси структурно родственных полисахаридов с определенными вариациями содержания углеводных единиц (l-фукопиранозные и нефукозные) и неуглеводных заместителей (в основном сульфатных и ацетильных групп. ). В силу этого обстоятельства точная оценка их конструкции и определение точного расположения второстепенных элементов конструкции практически не во всех случаях возможны. Таким образом, исследование их остовов и ветвей, образующих важные структурные мотивы, является основной целью структурного анализа фукоиданов.

    Таблица I.

    Изученный состав фукоиданов морских водорослей (в%, мас. / Мас.)

    Источник морских водорослей . Краткое название изображения . Fuc . ксил . Человек . Glc . галлон . уроновые кислоты . SO 3 Na .
    Laminaria saccharina L.s. 36,7 1,2 1,0 2,2 4,6 4,8 29,6
    Laminaria digitata L.d. 30,1 1,9 1,7 1,4 6,3 7,0 27,5
    Cladosiphon okamuranus C.о. 30,9 0,7 2,2 23,4 15,1
    Fucus evanescens F.e. 58,7 1,6 1,6 <1 36,3
    Fucus vesiculosus F.v. 26,1 2,4 3,1 2.2 5,0 10,3 23,6
    Fucus serratus F.se. 24,8 2,4 2,1 2,0 4,8 8,2 29,2
    Fucus distichus F.d. 40,8 0,8 0,8 <1 34,8
    Fucus spiralis F.с. 33,0 2,8 1,4 1,2 3,0 8,2 25,9
    Ascophyllum nodosum A.n. 26,6 4,4 2,6 1,1 4,7 9,4 24,4
    Источник морских водорослей . Краткое название изображения . Fuc . ксил . Человек . Glc . галлон . уроновые кислоты . SO 3 Na .
    Laminaria saccharina L.s. 36,7 1,2 1,0 2,2 4,6 4.8 29,6
    Laminaria digitata Л. 30,1 1,9 1,7 1,4 6,3 7,0 27,5
    Cladosiphon okamuranus C.o. 30,9 0,7 2,2 23,4 15,1
    Fucus evanescens F.е. 58,7 1,6 1,6 <1 36,3
    Fucus vesiculosus F.v. 26,1 2,4 3,1 2,2 5,0 10,3 23,6
    Fucus serratus F.se. 24,8 2,4 2.1 2,0 4,8 8,2 29,2
    Fucus distichus F.d. 40,8 0,8 0,8 <1 34,8
    Fucus spiralis F.s. 33,0 2,8 1,4 1,2 3,0 8,2 25.9
    Ascophyllum nodosum A.n. 26,6 4,4 2,6 1,1 4,7 9,4 24,4
    Таблица I.

    Исследованный состав фукоиданов морских водорослей (в%, мас. Источник водорослей . Краткое название изображения . Fuc . ксил . Человек . Glc . галлон . уроновые кислоты . SO 3 Na . Laminaria saccharina L.s. 36,7 1,2 1,0 2,2 4,6 4,8 29,6 Laminaria digitata L.d. 30,1 1,9 1,7 1,4 6,3 7,0 27,5 Cladosiphon okamuranus C.o. 30,9 0,7– 2,2– 23,4 15,1 Fucus evanescens F.e. 58,7 1,6–– 1.6 <1 36,3 Fucus vesiculosus F.v. 26,1 2,4 3,1 2,2 5,0 10,3 23,6 Fucus serratus F.se. 24,8 2,4 2,1 2,0 4,8 8,2 29,2 Fucus distichus F.d. 40,8 0,8–– 0,8 <1 34,8 Fucus spiralis F.s. 33,0 2,8 1,4 1,2 3,0 8,2 25,9 Ascophyllum nodosum A.n. 26,6 4,4 2.6 1,1 4,7 9,4 24,4

    Источник морских водорослей . Краткое название изображения . Fuc . ксил . Человек . Glc . галлон . уроновые кислоты . SO 3 Na .
    Laminaria saccharina L.s. 36,7 1,2 1,0 2,2 4,6 4,8 29,6
    Laminaria digitata L.d. 30,1 1,9 1,7 1,4 6,3 7,0 27,5
    Cladosiphon okamuranus C.о. 30,9 0,7 2,2 23,4 15,1
    Fucus evanescens F.e. 58,7 1,6 1,6 <1 36,3
    Fucus vesiculosus F.v. 26,1 2,4 3,1 2.2 5,0 10,3 23,6
    Fucus serratus F.se. 24,8 2,4 2,1 2,0 4,8 8,2 29,2
    Fucus distichus F.d. 40,8 0,8 0,8 <1 34,8
    Fucus spiralis F.с. 33,0 2,8 1,4 1,2 3,0 8,2 25,9
    Ascophyllum nodosum A.n. 26,6 4,4 2,6 1,1 4,7 9,4 24,4

    . ( II ) цепочки (рисунок 1).Цепи типа ( I ) организованы в виде повторяющихся (1 → 3) -связанных остатков α-1-фукопиранозы, тогда как цепи типа ( II ) содержат чередующиеся (1 → 3) – и (1 → 4) -связанные Остатки α-1-фукопиранозы. Эти две основные цепи могут нести углеводные [прежде всего l-фукопиранозу (Fuc) и d-глюкуроновую кислоту (GlcA)] и неуглеводные (сульфатные и ацетильные группы) заместители R, как показано на рисунке 1. Расположение второстепенных моносахаридных составляющих, а также обнаруженный в известных образцах фукоидана из морских водорослей [галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Xyl), глюкоза (Glc)], остается неизвестным.

    Рис. 1.

    Два типа основных цепей гомофукозы в фукоиданах бурых морских водорослей. Цепи ( I ) состоят только из повторяющихся (1 → 3) -связанных остатков α-1-фукопиранозы, тогда как цепи ( II ) содержат чередующиеся (1 → 3) – и (1 → 4) -связанные α-l -фукопиранозные остатки. R обозначает места потенциального присоединения углеводных (α-1-фукопираноза, α-d-глюкуроновая кислота) и неуглеводных (сульфатные и ацетильные группы) заместителей.

    Рис. 1.

    Два типа основных цепей гомофукозы в фукоиданах бурых морских водорослей. Цепи ( I ) состоят только из повторяющихся (1 → 3) -связанных остатков α-1-фукопиранозы, тогда как цепи ( II ) содержат чередующиеся (1 → 3) – и (1 → 4) -связанные α-l -фукопиранозные остатки. R обозначает места потенциального присоединения углеводных (α-1-фукопираноза, α-d-глюкуроновая кислота) и неуглеводных (сульфатные и ацетильные группы) заместителей.

    Полисахаридная цепь фукоидана из Laminaria saccharina (Usov et al. 1998) относится к типу ( I ) и состоит в основном из 4-сульфатированных (1 → 3) -связанных остатков α-1-фукопиранозы. A (фиг. 2), некоторые из которых дополнительно 2-сульфатированы ( B ) или несут 2- O -α-1-фукопиранозильный заместитель ( C ). Соотношение единиц A C составляет приблизительно 5: 1: 1, как оценивается анализом метилирования.

    Рис. 2.

    Сообщенные структурные мотивы для фукоиданов, выделенных из бурых морских водорослей L. saccharina ( A C ) (Usov et al. 1998), C. okamuranus ( A , D , E ) (Nagaoka et al. 1999; Sakai et al. 2003), F. evanescens ( F , G ) (Bilan et al. 2002), F. distichus ( G ) (Билан и др. 2004), F.vesiculosus ( F , H ) (Chevolot et al. 2001), A. nodosum ( F major, H , G minor) (Chevolot et al. 1999; 2001) и F. serratus ( F , G , I ) (Билан и др., 2006).

    Рис. 2.

    Сообщенные структурные мотивы для фукоиданов, выделенных из бурых морских водорослей L. saccharina ( A C ) (Usov et al. 1998), C.okamuranus ( A , D , E ) (Нагаока и др. 1999; Сакаи и др. 2003), F. evanescens ( F , G ) (Билан и др. 2002) , F. distichus ( G ) (Билан и др. 2004), F. vesiculosus ( F , H ) (Chevolot et al. 2001), A. nodosum ( F major, H , G minor) (Chevolot et al.1999; 2001) и F. serratus ( F , G , I ) (Bilan et al.2006 г.).

    Такая же (1 → 3) -связанная основная цепь типа ( I ) была обнаружена для фукоидана Cladosiphon okamuranus и, как было обнаружено, содержит несульфатированные ( A ), 4-сульфатированные ( D ) звенья и также ветвь ( E ), несущая α-d-глюкуронильные остатки, связанные через связь (1 → 2) (рис. 2). Соотношение Fuc: GlcA: сульфат в этом полисахариде составляет 6,1: 1: 2,9 (Nagaoka et al. 1999) или 4: 1: 2 (Sakai et al. 2003). Основная цепь аналогичного типа ( I ) находится в фукоидане, полученном из L.digitata (неопубликованные результаты Usov et al.), но расположение заместителей вдоль основной цепи еще предстоит исследовать.

    Другие препараты, выделенные из водорослей рода Fucus и Ascophyllum nodosum , содержат остов типа ( II ) с чередующимися (1 → 3) и (1 → 4) связями. В частности, фукоидан из F. evanescens состоит из повторяющихся звеньев ди- ( F ) и трисульфатированного ( G ) дисахарида в соотношении примерно 3: 1 (Bilan et al.2002), тогда как единицы G образуют основной фрагмент фукоидана из F. distichus (Bilan et al. 2004), который является сравнительно более регулярным, чем другие фукоиданы бурых морских водорослей.

    Цепь фукоидана из F. vesiculosus состоит в основном из единиц H (Chevolot et al. 2001), которые также присутствуют в фукоиданах из F. spiralis (Usov et al. Неопубликованные результаты ) и из A. nodosum в качестве основных повторяющихся звеньев вместе с второстепенными звеньями G и, возможно, некоторыми звеньями, содержащими другие заместители (ксилозу, фукозу или сульфатированную фукозу) в О-4 (Chevolot et al.1999; 2001). Основная цепь фукоидана из F. serratus состоит в основном из повторяющихся звеньев F (Билан и др., 2006), тогда как около половины 3-связанных остатков замещены в О-4 боковыми цепями трифукозида Я .

    Исследование образцов фукоидана методом гель-проникающей хроматографии продемонстрировало их сопоставимый профиль элюирования и преобладание полисахаридных фракций с молекулярной массой 200–500 кДа.

    Противовоспалительное действие фукоиданов бурых морских водорослей

    Ранее нами было показано (Преображенская и др.1997; Ушакова и др. 1999), что фукоидан из L. saccharina реагирует с L- и P-селектинами и снижает выход нейтрофилов [полиморфноядерных лейкоцитов (PMN)] в брюшную полость и вызывает острый перитонит. Настоящее исследование показало, что все фукоиданы в дозе около 4 мг / кг подавляли в разной степени экстравазацию нейтрофилов в брюшную полость на модели острого перитонита на крысах (таблица II). Наиболее активными ингибиторами были фукоиданы из L.saccharina и F. evanescens , которые ингибировали экстравазацию нейтрофилов более чем на 90% по сравнению с контролем. Наименее активными соединениями были фукоиданы из F. distichus и F. spiralis , которые ингибировали трансмиграцию нейтрофилов примерно на 60%. Во всех случаях различия между группами контрольных и обработанных животных были статистически значимыми ( P <0,05). Примечательно, что в этом анализе фукоидан из C.okamuranus продемонстрировал очень сильную ингибирующую активность, тогда как в других анализах он был значительно менее активен по сравнению с другими фукоиданами.

    Таблица II.

    Противовоспалительная и антикоагулянтная активность фукоиданов бурых морских водорослей

    9022 9022 9022 9022 9022 9022 9022 Laminaria digitata

    9021 4 9021 4 0,2 Источник Seaweed 6 .
    Источник морских водорослей . Воспаление a . АЧТВ (Ед / мг) b .
    n . Количество нейтрофилов на крысу (× 10 6 ) . Ингибирование (% от контроля) .
    Контроль c 16 42,2 ± 3,7
    Ламинария сахаринская 13 4 3.8 ± 1,8 91,0 24,2 ± 1,2
    Cladosiphon okamuranus 7 4,8 ± 1,5 88,6 0,5 ± 0,1
    92,9 15,1 ± 0,9
    Fucus vesiculosus 4 5,4 ± 3,6 87,2 9,4 ± 1,2
    Фукус 5 зубчатый9 ± 1,8 83,6 19,1 ± 1,6
    Fucus distichus 6 14,1 ± 3,2 66,6 26,9 ± 1,7
    146 спираль Fucus 6 3,1 66,4 13,6 ± 1,4
    Ascophyllum nodosum 4 8,9 ± 4,6 78,9 13,4 ± 1,1
    Воспаление a . АЧТВ (Ед / мг) b .
    n . Количество нейтрофилов на крысу (× 10 6 ) . Ингибирование (% от контроля) .
    Контроль c 16 42,2 ± 3,7
    Laminaria saccharina 13 2.5 ± 0,4 94,1 33,0 ± 2,0
    Laminaria digitata 4 3,8 ± 1,8 91,0 24,2 ± 1,2
    9226 1,5 88,6 0,5 ± 0,1
    Fucus evanescens 4 3,0 ± 0,2 92,9 15,1 ± 0,9
    Fucus vesiculos.4 ± 3,6 87,2 9,4 ± 1,2
    Fucus serratus 5 6,9 ± 1,8 83,6 19,1 ± 1,6
    Fucus4 3,2 66,6 26,9 ± 1,7
    Fucus spiralis 6 14,2 ± 3,1 66,4 13,6 ± 1,4
    8226 226 226 Ascoumphyll9 ± 4,6 78,9 13,4 ± 1,1
    Таблица II.

    Противовоспалительная и антикоагулянтная активность фукоиданов бурых морских водорослей

    94,196 9022 9022 9022 9022 9022 9022 Laminaria digitata
    Источник морских водорослей . Воспаление a . АЧТВ (Ед / мг) b .
    n . Количество нейтрофилов на крысу (× 10 6 ) . Ингибирование (% от контроля) .
    Контроль c 16 42,2 ± 3,7
    Laminaria saccharina 13 4 3,8 ± 1,8 91,0 24,2 ± 1,2
    Cladosiphon okamuranus 7 4.8 ± 1,5 88,6 0,5 ± 0,1
    Fucus evanescens 4 3,0 ± 0,2 92,9 15,1 ± 0,9
    us 5,4 Fucus6 vesic6 6,4 3,6 87,2 9,4 ± 1,2
    Зубчатый фукус 5 6,9 ± 1,8 83,6 19,1 ± 1,6
    9021 9021 9022 6 Fucus distichus 61 ± 3,2 66,6 26,9 ± 1,7
    Fucus spiralis 6 14,2 ± 3,1 66,4 13,6 ± 1,4
    621 Asodcophyum 4,6 78,9 13,4 ± 1,1
    9022 9022 9022 9022 9022 9022 9022 Laminaria digitata

    9021 4 9021 4 0,2
    Источник водорослей . Воспаление a . АЧТВ (Ед / мг) b .
    n . Количество нейтрофилов на крысу (× 10 6 ) . Ингибирование (% от контроля) .
    Контроль c 16 42,2 ± 3,7
    Ламинария сахаринская 13 4 3.8 ± 1,8 91,0 24,2 ± 1,2
    Cladosiphon okamuranus 7 4,8 ± 1,5 88,6 0,5 ± 0,1
    92,9 15,1 ± 0,9
    Fucus vesiculosus 4 5,4 ± 3,6 87,2 9,4 ± 1,2
    Фукус 5 зубчатый9 ± 1,8 83,6 19,1 ± 1,6
    Fucus distichus 6 14,1 ± 3,2 66,6 26,9 ± 1,7
    146 Fucus spy 6 3,1 66,4 13,6 ± 1,4
    Ascophyllum nodosum 4 8,9 ± 4,6 78,9 13,4 ± 1,1

    и данные представлены в таблицах сравнения данных I и II. Имеющаяся информация о структуре фукоиданов не показала какой-либо прямой связи между противовоспалительной активностью фукоиданов и содержанием моносахаридов и сульфатов, а также другими параметрами их основных цепей, такими как наличие точек ветвления.Тем не менее, принимая во внимание, что взаимодействие P- и L-селектинов с их рецепторами может быть ингибировано относительно небольшим природным лигандом, а именно тетрасахаридом сиалил-Льюис X (SLeX), можно ожидать, что SLeX может имитироваться некоторыми представленными структурными мотивами на фукоиданах, принадлежащих обеим группам ( I ) и ( II ). Этот вывод может быть подтвержден в будущем путем изучения активности фрагментов фукоиданов обоих типов, систематический синтез и конформационный анализ которых в настоящее время продолжаются (недавние сообщения из серии: Grachev et al.2006; Устужанина и др. 2006 г.).

    Влияние фукоиданов на адгезию PMN к покрытой пластинками стеклянной поверхности в условиях потока

    Чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе эффективности фукоиданов в снижении экстравазации PMNs в брюшину на модели воспалительного процесса у крыс, мы исследовали влияние фукоиданов на P-селектин-зависимую адгезию PMNs к адгезивным тромбоцитам в потоке. В этой модели блокирование Р-селектина специфическим антителом против Р-селектина (WAPS) почти полностью предотвращает адгезию PMN (рис. 3).Эти результаты продемонстрировали, что рекрутирование PMN в этой модели включает механизм, зависящий от P-селектина. В присутствии фукоиданов из L. saccharina , L. digitata , F. evanescens , F. serratus , F. distichus , F. spiralis и A. nodosum , ( 100 мкг / мл) адгезия PMN к монослоям тромбоцитов была снижена на 50–60% ( P <0,05) по сравнению с контролем. Напротив, такая же концентрация других фукоиданов не оказывала значительного влияния на это взаимодействие.

    Рис. 3.

    Влияние фукоиданов на адгезию полиморфноядерных лейкоцитов (PMN) к P-селектину, выраженное на покрытой тромбоцитами поверхности в условиях потока. Фукоиданы в конечной концентрации 100 мкг / мл добавляли к покрытой тромбоцитами поверхности и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Такая же концентрация фукоиданов была также добавлена ​​к суспензиям PMN перед добавлением PMN к тромбоцитам. В условиях потока наблюдали за миграцией PMN и фотографировали с помощью камеры.Было подсчитано количество прикрепленных PMN к полю. Представлены средние процентные значения ± SEM относительно контроля по крайней мере трех независимых экспериментов. * P <0,05.

    Рис. 3.

    Влияние фукоиданов на адгезию полиморфно-ядерных лейкоцитов (PMN) к P-селектину, выраженное на покрытой тромбоцитами поверхности в условиях потока. Фукоиданы в конечной концентрации 100 мкг / мл добавляли к покрытой тромбоцитами поверхности и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.Такая же концентрация фукоиданов была также добавлена ​​к суспензиям PMN перед добавлением PMN к тромбоцитам. В условиях потока наблюдали за миграцией PMN и фотографировали с помощью камеры. Было подсчитано количество прикрепленных PMN к полю. Представлены средние процентные значения ± SEM относительно контроля по крайней мере трех независимых экспериментов. * P <0,05.

    Антикоагулянтная активность фукоиданов

    Изучение антикоагулянтной активности на модели активированного частичного тромбопластинового времени (APTT) показало значительные различия между фукоиданами, полученными из разных морских водорослей (Таблица II).Испытанные фукоиданы можно условно разделить на три основные группы в соответствии с их антикоагулянтной активностью. Наиболее активными антикоагулянтами были фукоиданы из L. saccharina , L. digitata , F. distichus и F. serratus , активность которых превышала 19 условных единиц гепарина / мг. Фукоиданы второй группы, такие как фукоидан из F. evanescens , F. spiralis , A. nodosum и F. vesiculosus , проявляли активность примерно вдвое, составляя 9-15 Ед / мг.Примечательно, что фукоидан из C. okamuranus был наименее активным среди всех фукоиданов и практически не имел антикоагулянтного действия (Таблица II). Отсутствие его антикоагулянтной активности можно объяснить тем фактом, что этот препарат содержит наименьшее количество сульфата в его полисахаридной основе. Другой важной структурной особенностью, отличающей этот полисахарид от других, является наличие вицинальной 2,3-точки разветвления, образованной 2-O -α-d-глюкуронильными заместителями (Nagaoka et al.1999; Sakai et al. 2003 г.).

    Поскольку тромбин является первичным индуктором активации и коагуляции тромбоцитов, мы также исследовали влияние фукоиданов 100 мкг / мл на агрегацию тромбоцитов, вызванную тромбином. После воздействия фукоиданов из L. saccharina (рис. 4C) или других, таких как L. digitata , F. evanescens , F. serratus и F. distichus (рис. 4A), тромбоциты после дополнительного воздействия 0 не реагировал или не реагировал на него.5 Ед / мл тромбина, но агрегированный в ответ на пептид, активирующий рецептор тромбина (TRAP) или коллаген (рис. 4C). Более низкие концентрации (10 мкг / мл) тех же фукоиданов не предотвращали индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов (данные не показаны). В тех же условиях фукоидан из A. nodosum вызывал меньший эффект ингибирования агрегации, снижая на 50% эффекты тромбина, тогда как другие из C. okamuranus , F. vesiculosus и F.spiralis не мог предотвратить агрегацию тромбоцитов, вызванную тромбином (рис. 4А).

    Рис. 4.

    Влияние фукоиданов на агрегацию тромбоцитов человека. ( A ) Промытые тромбоциты предварительно инкубировали в отсутствие или в присутствии 100 мкг / мл фукоиданов и оценивали способность предотвращать индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов. Сообщалось о процентном содержании тромбин-индуцированной активации тромбоцитов в отсутствие или в присутствии различных фукоиданов.Данные собираются как минимум из трех независимых экспериментов. *** P <0,001; ** P <0,01; и * P <0,05. ( B , C ) Показаны характерные кривые агрегации. (B) Регистрировали агрегацию в ответ на тромбин 0,5 Ед / мл. (C) Добавление L. saccharina не вызывало агрегации промытых тромбоцитов человека. Затем добавляли тромбин и измеряли светопропускание в течение не менее 3 минут.

    Фиг.4.

    Влияние фукоиданов на агрегацию тромбоцитов человека. ( A ) Промытые тромбоциты предварительно инкубировали в отсутствие или в присутствии 100 мкг / мл фукоиданов и оценивали способность предотвращать индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов. Сообщалось о процентном содержании тромбин-индуцированной активации тромбоцитов в отсутствие или в присутствии различных фукоиданов. Данные собираются как минимум из трех независимых экспериментов. *** P <0,001; ** P <0.01; и * P <0,05. ( B , C ) Показаны характерные кривые агрегации. (B) Регистрировали агрегацию в ответ на тромбин 0,5 Ед / мл. (C) Добавление L. saccharina не вызывало агрегации промытых тромбоцитов человека. Затем добавляли тромбин и измеряли светопропускание в течение не менее 3 минут.

    Влияние фукоидана на формирование капилляроподобных структур эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) in vitro (тубулогенез)

    Чтобы определить, может ли различие в структурах фукоидана влиять на их способность модулировать ангиогенез, мы проанализировали их свойства в анализе тубулогенеза HUVEC in vitro.Было показано, что HUVEC образуют капиллярно-подобные структуры (трубки) при нанесении на матригель, и это явление известно как тубулогенез in vitro. Как видно на рисунке 5, в присутствии сыворотки HUVEC реорганизуются в структуры, похожие на пробирку, и этот эффект блокируется (99% ингибирования, P <0,0001) добавлением 100 мкг / мл фукоиданов из мкл. . saccharina , L. digitata , F. evanescens , F. serratus и F. distichus .Чтобы гарантировать, что подавление тубулогенеза HUVEC in vitro не вызвано токсическими эффектами, клетки анализировали с помощью теста исключения трипанового синего через 18 часов культивирования в присутствии фукоиданов, а затем сравнивали с контролями. Ни один из фукоиданов не вызвал значительной гибели клеток (данные не представлены).

    Рис. 5.

    Дифференциальные ингибирующие эффекты фукоиданов на тубулогенез эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). (A ) Репрезентативные изображения HUVEC на матригеле в присутствии фетальной бычьей сыворотки (FBS) вместе со 100 мкг / мл каждого из указанных фукоиданов.( B ) Количественный анализ образования трубок проводили путем подсчета закрытых областей (трубок) в четырех различных областях. Данные собираются как минимум из трех независимых экспериментов. *** P <0,001 и ** P <0,01.

    Рис. 5.

    Дифференциальные ингибирующие эффекты фукоиданов на тубулогенез эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). (A ) Репрезентативные изображения HUVEC на матригеле в присутствии фетальной бычьей сыворотки (FBS) вместе со 100 мкг / мл каждого из указанных фукоиданов.( B ) Количественный анализ образования трубок проводили путем подсчета закрытых областей (трубок) в четырех различных областях. Данные собираются как минимум из трех независимых экспериментов. *** P <0,001 и ** P <0,01.

    Фукоиданы из F. spiralis и A. nodosum были менее активными (рис. 5В), поскольку тубулогенез подавлялся лишь частично при их использовании в концентрации 100 мкг / мл. В тех же условиях добавление 100 мкг / мл фукоиданов из C.okamuranus и F. vesiculosus не мог нарушить образование трубок. Эти результаты подтвердили специфичность и селективность каждого полисахарида в регуляции ангиогенеза. В частности, сравнивая структуры фукоиданов из L. saccharina и C. okamuranus , можно предположить, что отсутствие антиангиогенной активности у последнего могло быть связано с более низким содержанием сульфатов и / или присутствием 2- O -α-d-глюкуронильных заместителей вдоль линейной полисахаридной основной цепи (Таблица I, Рисунок 2).

    Эффекты фукоидана на высвобождение ингибитора-1 активатора плазминогена (PAI-1) из HUVEC

    Чтобы идентифицировать потенциальный механизм, ответственный за антиангиогенную активность, описанную выше, мы измерили уровни PAI-1 в кондиционированной среде (CM) HUVEC, культивируемой в отсутствие или в присутствии фукоиданов. Как показано на Фигуре 6, уровни PAI-1 были заметно снижены, когда клетки подвергались воздействию фукоиданов из L. saccharina , L.digitata , F. serratus и F. distichus . Другие фукоиданы не влияли на высвобождение PAI-1. Добавление фетальной бычьей сыворотки (FBS) значительно увеличивало уровни PAI-1, присутствующего в CM HUVEC (174 нг / мл в CM по сравнению с 258,7 нг / мл в присутствии 10% FBS, P <0,01).

    Рис. 6.

    Эффект фукоиданов в ингибиторе активатора плазминогена-1 (PAI-1) (нг / мл), высвобождаемом из HUVEC. HUVEC помещали на матригель в присутствии или в отсутствие фукоиданов.Через 18 часов собирали супернатанты HUVEC и измеряли уровни PAI-1 с использованием коммерчески доступного набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

    Рис. 6.

    Эффект фукоиданов в ингибиторе активатора плазминогена-1 (PAI-1) (нг / мл), высвобождаемом из HUVEC. HUVEC помещали на матригель в присутствии или в отсутствие фукоиданов. Через 18 часов собирали супернатанты HUVEC и измеряли уровни PAI-1 с использованием коммерчески доступного набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

    Влияние фукоиданов на адгезию клеток рака груди к иммобилизованным тромбоцитам

    Несколько исследований установили ключевую роль взаимодействия опухолевых клеток и тромбоцитов как одного из самых ранних процессов, способствующих метастазированию опухолей (Hejna et al. 1999). Поэтому мы стремились определить влияние фукоиданов на адгезию высокометастатической линии клеток рака молочной железы MDA-MB-231 к покрытой тромбоцитами поверхности в статических условиях. Известно, что прилипшие тромбоциты частично высвобождают свое содержание α-гранул (Lahav and Hynes, 1981), активируются и экспрессируют различные гликопротеины (GP) или молекулы адгезии, такие как P-селектин и интегрины.Клетки рака груди добавляли на покрытую тромбоцитами поверхность в статических условиях. Фукоиданы (добавленные до конечной концентрации 100 мкг / мл) предварительно инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре с опухолевыми клетками (1 × 10 5 клеток). Клеткам давали прилипнуть к покрытым тромбоцитами планшетам на 1 час. После отмывки прикрепленные клетки фиксировали и окрашивали гематоксилином / эозином. Подсчитывали количество клеток, присутствующих в разных полях. Как показано на Фигуре 7, фукоиданы из L. saccharina , L.digitata , F. vesiculosus , F. serratus и F. distichus значительно снижали примерно на 80% ( P <0,01) адгезию опухолевых клеток к тромбоцитам человека. С другой стороны, фукоиданы из F. evanescens и A. nodosum были менее активны и показали 78% и 66% ингибирования соответственно ( P <0,05), тогда как фукоиданы из C. okamuranus и F. spiralis существенно не ингибировал гетеротипическую адгезию опухолевых клеток к тромбоцитам человека.

    Рис. 7.

    Влияние фукоиданов на адгезию клеток рака груди к тромбоцитам. ( A ) Клетки MDA-MB-231 предварительно инкубировали с фукоиданами перед воздействием на планшеты, покрытые тромбоцитами. Фотографии представляют как минимум три независимых эксперимента. ( B ) Количественную оценку клеточной адгезии проводили путем подсчета клеток, прикрепленных по крайней мере к трем различным полям. Результаты выражали в% обработанного образца по отношению к контролю ** P <0.01 и * P <0,05.

    Рис. 7.

    Влияние фукоиданов на адгезию клеток рака груди к тромбоцитам. ( A ) Клетки MDA-MB-231 предварительно инкубировали с фукоиданами перед воздействием на планшеты, покрытые тромбоцитами. Фотографии представляют как минимум три независимых эксперимента. ( B ) Количественную оценку клеточной адгезии проводили путем подсчета клеток, прикрепленных по крайней мере к трем различным полям. Результаты выражали в% обработанного образца по отношению к контролю ** P <0.01 и * P <0,05.

    Обсуждение

    Фукоиданы представляют собой интересную группу природных полисахаридов, которые могут иметь многообещающие терапевтические применения в различных клинических условиях. Поскольку фукоиданы водорослей характеризуются широким разнообразием биологической активности и очень сложной и гетерогенной структурой, которая, очевидно, различается в зависимости от вида водорослей, в настоящее время мы стремились определить, могут ли фукоиданы из разных источников по-разному влиять на воспаление, коагуляцию и некоторые связанные с раком процессы.

    Наши данные показывают, что i.v. Введение каждого фукоидана приводит к значительному снижению набора лейкоцитов в экспериментальной модели перитонита у крыс. Одним из возможных механизмов, с помощью которого фукоиданы могут успешно предотвращать накопление PMN, является вмешательство в связывающую активность P-селектина (Ushakova et al. 1999). Фактически, анализируя активность фукоиданов в проточной модели опосредованной P-селектином адгезии PMN к тромбоцитам, мы обнаружили, что только фукоиданы из L.saccharina , L. digitata , F. evanescens , F. serratus , F. distichus , F. spiralis и A. nodosum могут служить более эффективными ингибиторами Р-селектина, чем фукоидан. из C. okamuranus . Высокое содержание заместителя 2- O -α-d-глюкуронила в полисахаридной цепи фукоидана из C. okamuranus предполагает, что эти боковые ответвления могут ухудшать антиадгезивный эффект этого полисахарида.

    Наблюдаемый ингибирующий эффект фукоиданов на адгезию PMN к тромбоцитам согласуется с гипотезой о том, что фукоиданы могут ингибировать рекрутирование PMN в модели воспалительного перитонита, по крайней мере частично, путем нарушения адгезивной функции P-селектина. Однако нельзя исключить взаимодействие фукоиданов с другими рецепторами адгезии лейкоцитов; фактически сообщалось, что фукоиданы также могут связывать L-селектин (Ley et al. 1993). Более того, другие предполагаемые не зависящие от селектина механизмы, которые могут опосредовать активность фукоиданов in vivo, также могут быть приняты во внимание.Напр., Исследования на мышах с дефицитом селектина показывают, что селектины не требуются для наблюдаемых эффектов сульфатированных полисахаридов на мобилизацию стволовых клеток in vivo (Sweeney et al. 2000).

    Во многих исследованиях уже давно сообщается, что фукоиданы являются активными модуляторами коагуляции и представляют собой потенциальные терапевтические соединения в качестве альтернативы гепарину (Mourão 2004). В этом отношении мы подтвердили здесь, что, как и гепарин, все фукоиданы были способны продлевать время свертывания плазмы человека, за исключением C.Козловой . Интересно, что более высокая специфичность в отношении активности фукоидана наблюдалась в тесте на индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов. Мы задокументировали здесь, что только пять фукоиданов, происходящих из L. saccharina, L. digitata , F. distichus , F. serratus и F. evanescens , могут сильно ингибировать активность тромбина в агрегации тромбоцитов человека. Эффект антитромбина для некоторых фукоиданов был ранее описан в исследовании агрегации тромбоцитов у кроликов (Trento et al.2001). Наиболее правдоподобной гипотезой, объясняющей специфический ингибирующий эффект фукоиданов на тромбин-индуцированную активацию тромбоцитов, может быть их способность ингибировать каталитическую активность тромбина в концентрациях, используемых в настоящем исследовании. Подтверждая эту теорию, хроматографические исследования продемонстрировали, что тромбин действительно может связываться с фукоиданами (Minix and Doctor 1997). Кроме того, другие авторы показали, что некоторые сильно разветвленные сульфатированные фукоиданы из бурых водорослей непосредственно ингибируют тромбин (Pereira et al.1999). Однако возможность того, что, как и гепарин, фукоиданы могут ингибировать индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов, блокируя взаимодействие между тромбином и двумя его основными рецепторами на тромбоцитах человека, протеазно-активированным рецептором-1 и GP-1b (De Candia et al. 1999; 2001 ) не следует полностью исключать. Кроме того, мы предполагаем, что специфические антитромбиновые эффекты фукоиданов могут определяться специфическими особенностями их химической структуры. В частности, мы предполагаем, что высокое присутствие ответвлений глюкуроновой кислоты является наиболее вероятным признаком, ответственным за отсутствие антикоагулянтной активности, как это видно на примере C.okamuranus индуцированное фукоиданом влияние на анализ APPT (рис. 2; таблицы I и II). Тем не менее, отсутствие этой химической группы считалось важным, но не могло быть единственным фактором, определяющим антитромбиновые свойства фукоиданов (рис. 4).

    Антикоагулянты исторически предлагались в качестве дополнительного лечения рака, особенно из-за их способности отрицательно влиять на гемостаз и ангиогенез (Carmeliet 2003). Поэтому мы дополнительно исследовали антиангиогенные свойства фукоиданов in vitro.Интересно, что наши данные показывают, что фукоиданы, проявляющие сильные антитромбиновые свойства, такие как фукоиданы из L. saccharina , L. digitata , F. evanescens , F. serratus и F. distichus , также обладают сильным действием. ингибиторы тубулогенеза. Напротив, фукоиданы из C. okamuranus и F. vesiculosus (Таблица I) не обладают какой-либо ингибирующей активностью в отношении тубулогенеза. По нашему мнению, эти переменные эффекты на образование трубок могут быть связаны с различиями в химическом составе различных фукоиданов.В частности, менее активные соединения характеризуются низкой степенью сульфатирования и высоким присутствием 2- O -α-d-глюкуронильных заместителей вдоль линейного полисахаридного остова (см., Например, C. okamuranus ). С другой стороны, мы также наблюдали, что ингибирование тубулогенеза хорошо коррелировало со снижением уровней PAI-1, обнаруженным в супернатантах HUVEC, предполагая потенциальный механизм, ответственный за ингибирование ангиогенеза. Действительно, наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось о нескольких путях, с помощью которых PAI-1 может проявлять проангиогенную активность (Bajou et al.2001; Ким 2003). Снижение уровней PAI-1 может быть объяснено способностью фукоидана захватывать антиген PAI-1, который может вызывать образование комплекса фукоидан-PAI-1, тем самым снижая доступность PAI-1, как сообщалось ранее (Minix and Doctor 1997). . Однако нельзя исключать другие PAI-независимые механизмы, ответственные за ингибирующую активность, наблюдаемую в отношении тубулогенеза, поскольку сильный ингибитор тубулогенеза in vitro, F. evanescens , не вызывает значительного снижения уровней антигена PAI-1. в супернатантах HUVEC (рисунки 5 и 6).Более того, предварительные данные нашей группы документально подтвердили, что фукоидан из L. saccharina может полностью устранить bFGF-индуцированный тубулогенез (данные не показаны). В совокупности эти данные показывают, что некоторые фукоиданы могут служить мощными антиангиогенными агентами in vitro.

    Другой эффект, исследуемый в настоящем исследовании, связан с активностью фукоиданов на взаимодействиях тромбоцитов и опухолевых клеток. Растущее количество экспериментальных данных указывает на то, что образование агрегатов тромбоцитов и опухолей в кровотоке важно для облегчения процесса метастазирования (Hejna et al.1999), а блокада молекул адгезии тромбоцитов, таких как P-селектин (Kim et al. 1998), или комбинированное ингибирование GPIIb / IIIa и альфа V бета 3 интегрина может предоставить важные инструменты для подавления метастазирования опухоли (Trikha и др. 2002; Гомес и др. 2004). В связи с этим мы исследовали способность фукоиданов влиять на адгезию MDA-MB-231 (клетки рака груди) к тромбоцитам. Наши результаты показывают, что определенные фукоиданы могут значительно снизить количество клеток рака молочной железы, прикрепившихся к иммобилизованным тромбоцитам в статических условиях, тогда как полисахариды, полученные из C.okamuranus , обогащенный заместителями глюкуроновой кислоты, а также те, что из F. spiralis , не смогли предотвратить этот тип взаимодействия. Хотя мы не идентифицировали специфические молекулы клеточной адгезии, участвующие в межклеточных взаимодействиях, мы предполагаем, что, подобно гепарину (Borsig et al. 2001), фукоиданы могут первоначально блокировать опосредованную P-селектином клеточную адгезию. Более того, вклад других молекул адгезии гарантирован, поскольку использования только WAPS (антитела против P-селектина) было недостаточно для полного блокирования межклеточных взаимодействий (данные не показаны).Одной из возможных молекул-кандидатов, участвующих в этом процессе, может быть тромбоспондин, гепарин-связывающий GP, присутствующий в гранулах тромбоцитов (Lawler et al. 1978). Было показано, что после высвобождения тромбоспондин способен связываться с поверхностью покоящихся и активированных тромбоцитов (Nelson et al. 1993). С другой стороны, Incardona et al. (1996) показали, что, подобно гепарину, природный фукоидан способен блокировать связывание тромбоспондина с клетками рака молочной железы MDA-MB-231.Однако не следует исключать возможность того, что фукоиданы могут также блокировать другие важные молекулы-кандидаты, участвующие в адгезии опухолевых клеток к тромбоцитам, такие как интегрины (Haroun-Bouhedja et al. 2002; Liu et al. 2005).

    Материалы и методы

    Экстракция и очистка фукоиданов

    Фукоиданы, использованные в настоящей работе, перечислены в таблице I. Процедура выделения фукоиданов из L. saccharina была описана ранее (Usov et al.1998). Процедура включает экстракцию сухой обезжиренной биомассы водорослей разбавленным раствором хлорида кальция, осаждение кислых полисахаридов с помощью цетавлона, преобразование солей цетавлоновой кислоты в соли кальция и щелочную обработку для удаления ацетильных групп (если они есть в природном полисахариде). и превратить фукоидан в натриевую соль. По той же методике были получены препараты L. digitata , F. vesiculosus , F. spiralis и A.nodosum из соответствующих водорослей (Таблица I). Три препарата были выделены аналогичными процедурами экстракции, но щелочная обработка была опущена и была проведена ионообменная хроматография нативного полисахарида для получения наиболее сульфатированной фракции. С помощью этого метода получают полисахариды из F. evanescens (Билан и др., 2002), F. serratus (Билан и др. 2006) и F. distichus (Билан и др. 2004) (для подробных процедур выделения см. см. цитируемые работы).Фукоидан из C. okamuranus был подарком д-ра М. Иха (South Product Co. Ltd, Сузаки, Япония). Структура полисахарида из C. okamuranus была исследована ранее (Nagaoka et al. 1999; Sakai et al. 2003), и этот препарат в настоящее время изучается как ингибитор клеточной адгезии Helicobacter pylori (Shibata et al. . 2003), но также проявляет другие биологические свойства (Shibata et al. 2000; Matsumoto et al. 2004). Содержание моносахаридов и сульфатов в фукоиданах определяли, как описано ранее (Usov et al.1998; Билан и др. 2002; 2004 г.).

    Определение фукоиданов методом гель-проникающей хроматографии

    Молекулярно-массовое распределение образцов фукоидана охарактеризовано гель-проникающей хроматографией на колонке с гелем TSK-HW-65 (S) (2,7 × 60 см, диапазон разделения 10–1000 кДа) при элюировании водой (2 мл / мин) и детектирование с помощью дифференциального рефрактометра (Knauer, Берлин, Германия). Стандартные образцы декстрана (50, 75, 150, 250 и 500 кДа) использовали для калибровки колонки.

    Модель воспаления брюшины у крысы

    Модель острого перитонита на крысах использовалась, как описано ранее (Ushakova et al., 1999), с некоторыми модификациями. Самкам крыс линии Wistar (около 250 г) под эфирной анестезией внутрибрюшинно вводили 9,0% раствор пептона (7 мл) в 0,9% NaCl. Фукоиданы вводили крысам в бедренную вену в стерильном 0,9% растворе NaCl (0,3 мл) через 15 мин после инъекции пептона. Контрольным животным вводили такой же объем 0,9% NaCl.Через 3 часа животных анестезировали, умерщвляли и их брюшные полости промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) (30 мл), содержащим гепарин (60 Ед / мл), 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,03% бычьей сыворотки с энергичной брюшиной. массаж 1 мин. Подсчитывали количество клеток в промывной жидкости и концентрировали клеточную суспензию центрифугированием при 400 г в течение 10 мин. Осадок клеток затем разбавляли 1: 1 бычьей сывороткой; мазки готовили и окрашивали по методу Паппенгейма.Количество PMN определяли в двух параллельных мазках по 600 клеток в каждом.

    Выделение тромбоцитов и PMN из крови человека

    Кровь была взята у здоровых добровольцев, которые не принимали никаких лекарств в течение как минимум 2 недель. Девять частей крови подвергали антикоагуляции одной частью 3,8% тринатрийцитрата. Человеческие тромбоциты получали дифференциальным центрифугированием, как описано (Cumashi et al. 2001). После удаления богатой тромбоцитами плазмы PMN выделяли путем осаждения декстрана с последующим градиентом фиколла-гипака и гипотоническим лизисом эритроцитов.PMN промывали и ресуспендировали в буфере HEPES-Tyrode (pH 7,4), содержащем 129 ммоль / л NaCl, 9,9 ммоль / л NaHCO 3 , 2,8 ммоль / л KCl, 0,8 ммоль / л KH 2 PO 4 , 0,8 ммоль / л MgCl 2 · 6H 2 O, 5,6 ммоль / л глюкозы, 10 ммоль / л HEPES и 1 ммоль / л CaCl 2.

    Монослои тромбоцитов

    Стеклянные покровные стекла покрывали 4% 3-аминопропилтриэтоксисиланом (APES) в ацетоне. Суспензия тромбоцитов 0,5 мл в 1 моль / л Ca 2 + , содержащая 3.5 × 10 7 PLT / мл расслаивали на предметном стекле, покрытом APES, и тромбоцитам давали возможность прикрепиться в течение 3 часов при комнатной температуре. Плотность и слияние слоев тромбоцитов исследовали с помощью световой микроскопии.

    Анализ адгезии в потоке

    Адгезию

    PMN в физиологическом потоке исследовали в проточной камере с параллельными пластинами. Покрытые пластинками предметные стекла помещали в проточную камеру и помещали в терморегулируемую коробку из оргстекла, поддерживаемую при 37 ° с помощью электрического нагревательного элемента.Поверхность тромбоцитов перфузировали 5 мл суспензии PMN [10 6 мл -1 в 0,1% среде бычьего сывороточного альбумина – модифицированной по Дульбекко среде орла (BSA-DME)] при напряжении сдвига стенки 2 дин / см 2 в течение 2 минут с последующей перфузией средой без клеток при напряжении сдвига стенки 10 дин / см 2 в течение 2 минут для удаления неприлипающих PMN. Взаимодействие PMN с тромбоцитами наблюдали с помощью фазово-контрастной видеомикроскопии с объективом 10x (Olympus, Гамбург, Германия), и изображения непрерывно записывались для анализа воспроизведения (видеокамера Pro-Series, высокопроизводительная камера CCD, Media Cybernetics, Silver Spring , Д.м.н.).Прилипшие PMN подсчитывали в конце перфузии в четырех рандомизированных полях с использованием специального программного обеспечения для анализа изображений (Image Pro-Plus для Windows, Media Cybernetics, Silver Spring, MD) и представляли как среднее значение ± SEM. Р-селектин иммунологически блокировали путем инкубации тромбоцитов с моноклональным антителом WAPS 12.2 (20 мкг / мл) в течение 10 мин при комнатной температуре. Фукоиданы добавляли к поверхности тромбоцитов в течение 15 минут в концентрации 100 мкг / мл, а затем подвергали воздействию суспензии PMN.

    Анализ времени свертывания

    Антикоагулянтное действие фукоиданов измеряли в анализе свертывания APTT согласно Anderson et al.(1976). Нормальную объединенную плазму человека (80 мкл) смешивали с раствором (20 мкл) фукоидана (0–5 мкг) в 0,9% NaCl, и смесь инкубировали в течение 1 мин при 37 ° C. После этого добавляли раствор (100 мкл), содержащий смесь фосфолипидов и активатора, полученную смесь инкубировали 2 мин при 37 ° C. Наконец, к смеси добавляли раствор 0,025 M CaCl 2 (100 мкл), предварительно нагретый до 37 ° C. Время образования сгустка определялось. Активность фукоиданов выражали в единицах гепарина / мг с использованием параллельной кривой, полученной с использованием стандарта гепарина (Fluka, Buchs, Швейцария; 140 МЕ / мг активности).

    Тест агрегации тромбоцитов

    Тест на агрегацию тромбоцитов выполняли, как описано (Cumashi et al. 2001). Вкратце, 500 мкл промытых тромбоцитов 10 8 / мл в 1 ммоль / л Ca 2 + -содержащих HEPES-Tyrode’s инкубировали при непрерывном перемешивании при 37 ° C в силанизированных стеклянных пробирках, помещенных в агрегометр. Агрегацию тромбоцитов выражали как увеличение светопропускания, наблюдаемое после добавления тромбина (0,5 Ед / мл). Фукоиданы, 100 мкг / мл, добавляли к тромбоцитам перед тромбином.Через пять минут после тромбина добавляли другой стимул, TRAP (50 мкг / мл) или коллаген (30 мкг / мл), чтобы оценить, сохраняют ли тромбоциты способность к агрегации.

    Клеточные культуры

    HUVEC выделяли расщеплением коллагеназой, как описано (Gimbrone, 1976). Эндотелиальные клетки выращивали на покрытых желатином чашках в среде 199, содержащей 10% FBS (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), с добавлением 12 ед / мл гепарина и 50 мг / мл неочищенного фактора роста эндотелиальных клеток крупного рогатого скота (ECGF) при 37 ° C. ° C при 5% CO 2 .HUVEC от пассажа 1 до 5 использовали для экспериментов. Клетки рака молочной железы MDA-MB-231 выращивали в среде DME с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS.

    Анализ тубулогенеза

    Способность фукоиданов модулировать ангиогенез in vitro оценивали в образовании капиллярной трубки (анализ тубулогенеза), как описано ранее (Rabinovich et al. 2006). Вкратце, предметные стекла камеры покрывали матригелем с обедненным фактором роста (Becton Dickinson, Bedford, MA) в течение 1 ч при 37 ° C.HUVEC, ресуспендированные в M199, содержащем 10% FBS, высевали на матригель (5 × 10 4 / первелл). Фукоиданы добавляли до конечной концентрации 100 мкг / мл. После 18–20 ч инкубации при 37 ° C и 5% CO 2 культуры фотографировали. Для каждой отдельной лунки были сделаны три оцифрованных фотографии из разных мест. Фотографии были проанализированы программой ImagePro Plussoftware (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) и подсчитаны закрытые области (трубчатые структуры). Продолжительность образования пробирок выражали как долю пробирок (%), обнаруженную в образцах, обработанных фукоиданом, по сравнению с контрольными образцами.Окончательные результаты были объединены по крайней мере из трех независимых экспериментов.

    Анализ PAI-1

    Уровни

    PAI-1 измеряли в КМ из HUVEC, помещенных на матригель для анализа тубулогенеза, в присутствии или в отсутствие фукоиданов. После 20 ч инкубации КМ собирали, центрифугировали и хранили. Аликвоты CM размером пять микролитров анализировали с использованием специфического иммуноферментного анализа (ELISA; American Diagnostica GmbH, Pfungstadt, Германия).

    Анализ адгезии тромбоцитов к опухолевым клеткам in vitro

    Для анализа адгезии опухолевых клеток поверхности, покрытые тромбоцитами, получали, как описано (Karpatkin et al.1988 г.) с доработками. Суспензию тромбоцитов 0,1 мл, содержащую 3 × 10 7 тромбоцитов в буфере HEPES Tyrode, добавляли в плоскодонные пластиковые лунки для микропигментации. Планшеты инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После этого к тромбоцитам добавляли такой же объем буфера HEPES-Tyrode, обогащенного 2 мМ Ca 2 + . Затем планшет оставляли на ночь при 4 ° C. На следующий день неприлипшие тромбоциты удаляли промыванием PBS плюс 1% BSA. Добавляли двести микролитров этого раствора и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы заблокировать «свободные прилипшие» участки на пластике.Опухолевые клетки отделяли и ресуспендировали в PBS, обогащенном Ca 2 + и Mg 2 + . После подсчета 1 × 10 5 клеток добавляли в каждую лунку, покрытую тромбоцитами, в присутствии или в отсутствие 100 мкг / мл фукоиданов и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Затем планшеты дважды промывали и фиксировали метанолом. Прилипшие клетки окрашивали с помощью раствора гематоксилин / эозин, чтобы сделать видимыми ядра раковых клеток.

    Статистический анализ

    Статистическая значимость среди различных экспериментальных групп определялась с помощью критерия Стьюдента t .Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.

    Выводы

    Наши данные демонстрируют, что фукоиданы, полученные из видов бурых водорослей, отличных от традиционно изученных F. vesiculosus и A. nodosum , могут действовать как ингибиторы воспаления, ангиогенеза и адгезии гетеротипических опухолевых клеток. Результаты, описанные в данном документе, могут свидетельствовать о важности 2-O -α-d-глюкуронильной ветви в снижении некоторых биологических активностей при более слабом ингибирующем потенциале C.okamuranus фукоидан не из-за более низкого содержания сульфатов. Напротив, структура полисахаридного остова (тип I по сравнению с типом II ) кажется менее критичной. Это можно объяснить наличием биологических релевантных структурных элементов на обоих полисахаридных каркасах или неспецифическими механизмами, включая их полианионную структуру. Таким образом, сниженная ингибирующая активность 2- O -α-d-глюкуронилированных полисахаридов может быть связана с соответствующими конформационными изменениями линейного остова под влиянием вицинального ветвления, которые мы могли наблюдать, используя соответствующие модели синтетических олигосахаридов (Gerbst et al. ., неопубликованные результаты).

    Среди изученных соединений фукоидан из L. saccharina , по-видимому, является более мощным ингибитором ангиогенеза и адгезии опухолевых клеток к тромбоцитам. Дальнейшие исследования различных сульфатированных фракций этого полисахарида (полученные с помощью ионообменной хроматографии) и синтетических фрагментов продолжаются, чтобы очертить структурные мотивы, ответственные за различные биологические активности. Эта информация может открыть перспективу для разработки новых малотоксичных агентов для лечения тромбоза, воспаления и прогрессирования опухоли.

    Благодарности

    Мы благодарим Рэйчел Миллер (Loch Duart Ltd, Badcall Salmon House, Scourie, Lairg, Sutherland, IV27 4TH, UK) и Ангуса Моррисона (Biolitec Pharma Ltd, Breasclete, Isle of Lewis, Scotland, HS2 9ED, UK) за любезную помощь в сбор и сушку водорослей, а также доктору Патриции Ди Грегорио и Габриэле Мерсиаро из больницы SS Annunziata «Центр переливания крови», Кьети, Италия, за полезное сотрудничество. Мы в долгу перед доктором Вирджилио Евангелистой за рецензию на рукопись.Работа частично поддержана GlycoSense AG (Йена, Германия) и Российским фондом фундаментальных исследований (гранты 04-04-49464a и 06-03-33080).

    Заявление о конфликте интересов

    Не объявлено.

    Сокращения

    • APES

      3-аминопропилтриэтоксисилан

    • APTT

      активированное частичное тромбопластиновое время

    • bFGF

      базовый фактор роста фибробластов

      000 9000

    • Модифицированный Дульбекко орел

    • ELISA

      Иммуноферментный анализ

    • FBS

    • GP

    • HUVEC

      человеческий концевой ингибитор иммуноглобулина

      человеческий концевой ингибитор -1

    • PBS

      фосфатно-солевой буфер

    • PMN

      полиморфно-ядерных лейкоцитов

    • SLeX

    • TRAP

    • 3 тромбиновый рецептор

    • ,,,,.

      Антикоагулянтные свойства гепарина, фракционированного аффинной хроматографией на связанном с матриксом антитромбине III и гель-фильтрацией

      ,

      Thromb Res

      ,

      1976

      , vol.

      9

      (стр.

      575

      583

      ),,,,,,,,,,,,,,,.

      Ингибитор активатора плазминогена PAI-1 контролирует васкуляризацию опухоли in vivo посредством взаимодействия с протеазами, а не с витронектином. Значение для антиангиогенных стратегий

      ,

      J Cell Biol

      ,

      2001

      , vol.

      152

      4

      (стр.

      777

      1784

      ),.

      Сульфатированные фуканы, свежие перспективы: структуры, функции и биологические свойства сульфатированных фуканов и обзор ферментов, активных по отношению к этому классу полисахаридов

      ,

      Glycobiology

      ,

      2003

      , vol.

      13

      (стр.

      29R

      40R

      ),,,,.

      Структура фукоидана из бурых водорослей Fucus serratus L

      ,

      Carbohydr Res

      ,

      2006

      , vol.

      341

      (стр.

      238

      245

      ),,,,,.

      Структура фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens C.Ag

      ,

      Carbohydr Res

      ,

      2002

      , vol.

      337

      (стр.

      719

      730

      ),,,,,.

      Высокорегулярная фракция фукоидана из бурых морских водорослей Fucus distichus L

      ,

      Carbohydr Res

      ,

      2004

      , vol.

      339

      (стр.

      511

      517

      ),,,,,,.

      Биологическая активность полисахарида морских водорослей

      ,

      Drugs Fut

      ,

      1995

      , vol.

      20

      (стр.

      1237

      1249

      ),,,,,.

      Еще раз о гепарине и раке: механистические связи с участием тромбоцитов, Р-селектина, муцинов карциномы и метастазов опухоли

      ,

      Proc Natl Acad Sci

      ,

      2001

      , vol.

      98

      6

      (стр.

      3352

      3357

      ).

      Ангиогенез в здоровье и болезни

      ,

      Nat.Мед

      ,

      2003

      , т.

      9

      6

      (стр.

      653

      660

      ),,,,,,.

      Дополнительные данные о структуре фуканов бурых водорослей: взаимосвязь с антикоагулянтной активностью

      ,

      Carbohydr Res

      ,

      1999

      , vol.

      319

      (стр.

      154

      165

      ),,,,.

      Повторяющаяся дисахаридная единица является основной структурой фукоиданов двух видов бурых водорослей

      ,

      Carbohydr Res

      ,

      2001

      , vol.

      330

      (стр.

      529

      535

      ),,,.

      Анализ ингибирования метастазирования опухоли сульфатными полисахаридами. Инт

      ,

      Дж. Рак

      ,

      1987

      , т.

      39

      (стр.

      82

      88

      ),,,,,,.

      Нейтрофильные протеазы могут инактивировать человеческий PAR3 и отменять корецепторную функцию PAR3 на тромбоцитах мышей

      ,

      Thromb Haemost

      ,

      2001

      , vol.

      85

      (стр.

      533

      538

      ),,.

      Сульфатированные полисахариды морских водорослей в качестве противовирусных агентов

      ,

      Curr Med Chem

      ,

      2004

      , vol.

      18

      (стр.

      2399

      2419

      ),,.

      Активация тромбоцитов, индуцированная тромбином, ингибируется гепарином с высокой и низкой молекулярной массой

      ,

      Circulation

      ,

      1999

      , vol.

      99

      (стр.

      3308

      3314

      ),,,,,.

      Связывание тромбина с гликопротеином Ib ускоряет гидролиз Par-1 на интактных тромбоцитах

      ,

      J Biol Chem

      ,

      2001

      , vol.

      276

      (стр.

      4692

      4698

      ),,,,,,,.

      Три члена семейства рецепторов селектина распознают общий углеводный эпитоп, сиалил-Льюис (x) олигосахарид

      ,

      J Cell Biol

      ,

      1992

      , vol.

      117

      (стр.

      895

      902

      ),,,,,,,,.

      Сцинтилляционный анализ близости для E-, P- и L-селектина с использованием неогликоконъюгатов на основе полиакриламида в качестве лигандов

      ,

      Anal Biochem

      ,

      1998

      , vol.

      258

      (стр.

      127

      135

      ).

      Культура эндотелия сосудов

      ,

      Prog Haemost Thromb

      ,

      1976

      , vol.

      3

      (стр.

      1

      28

      ),,,,,.

      Адгезия клеток аденокарциномы молочной железы к субэндотелию сосудов в цельной крови и в условиях кровотока: эффекты α V β 3 и α IIb β 3 антагонистов

      ,

      Clin. Exp. Метастаз

      ,

      2004

      , т.

      21

      (стр.

      553

      561

      ),,,,.

      Синтез, ЯМР и конформационные исследования фрагментов фукоидана. IX. ЯМР-исследование влияния сульфатной группы у C-2 и C-4 на конформационное поведение фукоидановых фрагментов с гомо- (1 → 3) -связанной основной цепью

      ,

      J. Carbohydr. Chem

      ,

      2006

      , т.

      25

      (стр.

      315

      330

      ),,,.

      Влияние полисахарида фукоидина на интерлейкин-1 спинномозговой жидкости и фактор некроза опухоли α при пневмококковом менингите у кроликов

      ,

      Infect.Иммун

      ,

      1999

      , т.

      67

      (стр.

      2071

      2074

      ),,,,.

      Новые природные полисахариды с сильным антитромбическим действием: фуканы из бурых водорослей

      ,

      Биоматериалы

      ,

      1989

      , т.

      10

      (стр.

      363

      368

      ),,,,,.

      In vitro эффекты фуканов на адгезию и инвазию опухолевых клеток MDA-MB231

      ,

      Anticancer Res

      ,

      2002

      , vol.

      22

      (стр.

      2285

      2292

      ),,.

      Ингибирование метастазов антикоагулянтами

      ,

      J Natl Cancer Inst

      ,

      1999

      , vol.

      91

      (стр.

      22

      36

      ),,,,,,.

      Гепарин-связывающий домен, повторы типа 1 и типа 2 тромбоспондина опосредуют его взаимодействие с клетками рака молочной железы человека

      ,

      J Cell Biochem

      ,

      1996

      , vol.

      62

      (стр.

      431

      442

      ),,,.

      Роль адгезивных белков во взаимодействии тромбоцитов с опухолью in vitro и образовании метастазов in vivo

      ,

      J Clin Invest

      ,

      1988

      , vol.

      81

      (стр.

      1012

      1019

      ).

      Флавоноиды ингибируют VEGF / bFGF-индуцированный ангиогенез in vitro путем ингибирования протеаз, разрушающих матрикс

      ,

      J Cell Biochem

      ,

      2003

      , vol.

      89

      (стр.

      529

      538

      ),,,.

      Дефицит P-селектина подавляет рост опухоли и метастазирование

      ,

      Proc Natl Acad Sci

      ,

      1998

      , vol.

      95

      16

      (стр.

      9325

      9330

      ),,,,.

      Чрезмерное сульфатирование фукоидана усиливает его антиангиогенную и противоопухолевую активность

      ,

      Biochem Pharmacol

      ,

      2003

      , vol.

      65

      (стр.

      173

      179

      ),,.

      Терапевтический потенциал ингибирования перекатывания лейкоцитов при ишемии / реперфузии

      ,

      J Clin Invest

      ,

      1995

      , vol.

      95

      (стр.

      2510

      2519

      ),,,,,.

      Антикоагулянтная активность фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens Охотского моря

      ,

      Bull Exp Biol Med

      ,

      2003

      , т.

      136

      (стр.

      532

      534

      ),.

      Участие фибронектина фактора фон Виллебранда и фибриногена во взаимодействии тромбоцитов с твердыми субстратами

      ,

      J Supramol Struct Cell Biochem

      ,

      1981

      , vol.

      17

      (стр.

      299

      311

      ),,.

      Выделение и характеристика высокомолекулярного гликопротеина из тромбоцитов крови человека

      ,

      J Biol Chem

      ,

      1978

      , vol.

      253

      (стр.

      8609

      8616

      ),,,,.

      Фукоидин, но не дрожжевой полифосфоманнан PPME, ингибирует перекатывание лейкоцитов в венулах брыжейки крысы

      ,

      Blood

      ,

      1993

      , vol.

      81

      (стр.

      177

      185

      ),,,,,,,.

      Ингибирующее действие фукоидана на адгезию клеток аденокарциномы к фибронектину

      ,

      Anticancer Res

      ,

      2005

      , vol.

      25

      (стр.

      2129

      2133

      ),,,,,.

      Фукоидан, полученный из Cladosiphon okamuranus Tokida облегчает хронический колит у мышей за счет подавления выработки интерлейкина-6 эпителиальными клетками толстой кишки

      ,

      Clin Exp Immunol

      ,

      2004

      , vol.

      136

      (стр.

      432

      439

      ),,,,,,.

      Венозная антитромботическая и антикоагулянтная активность фракции фукоидана

      ,

      Thromb Haemost

      ,

      1995

      , vol.

      74

      (стр.

      1280

      1285

      ),,,,.

      Фукоидан – неантикоагулянтный ингибитор гиперплазии интимы

      ,

      Biochem Biophys Res Commun

      ,

      1992

      , vol.

      184

      (стр.

      773

      781

      ),.

      Взаимодействие фукоидана с протеазами и ингибиторами свертывания и фибринолиза

      ,

      Thromb Res

      ,

      1997

      , vol.

      87

      5

      (стр.

      419

      429

      ).

      Использование сульфатированных фуканов в качестве антикоагулянтов и антитромботических агентов: перспективы на будущее

      ,

      Curr Pharm Des

      ,

      2004

      , vol.

      10

      (стр.

      967

      981

      ),,,,,,,,.

      Структурное исследование фукоидана из Cladosiphon okamuranus TOKIDA

      ,

      Glycoconjugate J

      ,

      1999

      , vol.

      16

      (стр.

      19

      26

      ),,,,,.

      Антикоагулянт низкомолекулярных фуканов, полученных радикальным способом и ионообменной хроматографией высокомолекулярных фуканов, экстрагированных из бурых морских водорослей Ascophyllum nodosum

      ,

      Carbohydr Res

      ,

      1996

      , vol.

      289

      (стр.

      201

      208

      ),,,,,.

      Гепариновые олигосахариды связывают L- и P-селектин и подавляют острое воспаление

      ,

      Кровь

      ,

      1993

      , vol.

      82

      (стр.

      3253

      3258

      ),,,.

      Защитные эффекты полисахарида фукоидина при ишемии-реперфузии миокарда у крыс

      ,

      J Cardiovasc Pharmacol

      ,

      1997

      , vol.

      30

      (стр.

      717

      724

      ),,.

      Состав и антикоагулянтная активность сульфатированных фуканов. Сравнение обычных, повторяющихся и линейных фуканов из иглокожих с более гетерогенными и разветвленными полимерами из бурых водорослей

      ,

      J Biol Chem

      ,

      1999

      , vol.

      274

      (стр.

      7656

      7667

      ),,,,,.

      Селективное расщепление и антикоагулянтная активность сульфатированного фукана: стереоспецифическое удаление сложного 2-сульфатного эфира из полисахарида путем слабого кислотного гидролиза, получение олигосахаридов и антикоагулянтная активность, зависимая от кофактора II гепарина

      ,

      Гликобиология

      ,

      .

      15

      (стр.

      369

      381

      ),,,,,,,,.

      Фукоидан подавляет рекрутирование лейкоцитов в модели воспаления брюшины у крысы и блокирует взаимодействие Р-селектина с его углеводным лигандом.Биохим

      ,

      Мол Биол Инт

      ,

      1997

      , т.

      43

      (стр.

      443

      451

      ),,,,,,,,,.

      Синтетические амины лактулозы: новый класс противоопухолевых агентов, которые вызывают апоптоз опухолевых клеток и ингибируют опосредованную галектином агрегацию гомотипических клеток и in vitro ангиогенез

      ,

      Glycobiology

      ,

      2006

      , vol.

      16

      (стр.

      210

      220

      ),,

      Pinczon du Sel D, Bosch

      S

      ,,,,,,.

      Противоопухолевые и антипролиферативные эффекты фукана, экстрагированного из Ascophyllum nodosum , против линии немелкоклеточной бронхолегочной карциномы

      ,

      Anticancer Res

      ,

      1996

      , vol.

      16

      (стр.

      1213

      1218

      ),,,,.

      Структуры олигосахаридов, полученных из фукоидана Cladosiphon okamuranus путем переваривания морскими бактериальными ферментами

      ,

      Mar Biotechnol

      ,

      2003

      , vol.

      5

      (стр.

      536

      544

      ),,,,,,,,,.

      Профилактическое действие фукоидана Cladosiphon против инфекции Helicobacter pylori у монгольских песчанок

      ,

      Helicobacter

      ,

      2003

      , vol.

      8

      (стр.

      59

      65

      ),,,,,,,.

      Свойства фукоидана из Cladosiphon okamuranus Tokida в защите слизистой оболочки желудка

      ,

      BioFactors

      ,

      2000

      , vol.

      11

      (стр.

      235

      245

      ),,,.

      Сверхсульфатированный фукоидан ингибирует индуцированное основным фактором роста фибробластов образование трубок эндотелиальными клетками пупочной вены человека: его возможный механизм действия

      ,

      Biochim Biophys Acta

      ,

      2000

      , vol.

      1497

      (стр.

      127

      134

      ),,,,

      Beaudet AL, Papayannopoulou

      T

      .

      Мобилизация стволовых клеток / клеток-предшественников сульфатированными полисахаридами не требует наличия селектина

      ,

      Proc Natl Acad Sci USA

      ,

      2000

      , vol.

      97

      (стр.

      6544

      6549

      ),,,,.

      Антитромбиновая активность полисахарида водорослей

      ,

      Thromb Res

      ,

      2001

      , т.

      102

      (стр.

      457

      465

      ),,,,,,.

      Множественные роли GPIIb / IIIa тромбоцитов и α V β 3 интегринов в росте опухоли, ангиогенезе и метастазировании

      ,

      Cancer Res

      ,

      2002

      , vol.

      62

      (стр.

      2824

      2833

      ),,,,,,.

      Ингибирующая активность мономерных и полимерных лигандов селектина

      ,

      Probl Med Chem

      ,

      1999

      , vol.

      45

      (стр.

      375

      383

      ),,,.

      Полисахариды водорослей. 53. Бурая водоросль Laminaria saccharina (L.) Lam. в качестве источника фукоидана

      ,

      Russ J Bioorgan Chem

      ,

      1998

      , vol.

      24

      (стр.

      437

      445

      ),,,.

      Синтез, ЯМР и конформационные исследования фрагментов фукоидана.VIII. Конвергентный блочный синтез длинноцепочечных линейных и 2,3-разветвленных олигосахаридов

      ,

      Synthesis

      ,

      2006

      (стр.

      4017

      4031

      ),,,,.

      Противоопухолевое действие морских водорослей. IV. Повышение противоопухолевой активности путем сульфатирования неочищенной фракции из Sargassum kjellmanianum

      ,

      Jpn J Exp Med

      ,

      1984

      , vol.

      54

      (стр.

      143

      151

      )

      © Автор 2007.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *